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E cellule cancerose anu evolutu diversi miccanismi per superà u stress cellulare è cuntinueghjanu à prugressu.A protein kinase R (PKR) è u so attivatore di proteina (PACT) sò i rispunsevuli iniziali chì monitoranu diversi signali di stress chì portanu à l'inibizione di a proliferazione cellulare è l'apoptosi.Tuttavia, a regulazione di a via PACT-PKR in e cellule cancerose resta largamente scunnisciuta.Quì, truvamu chì l'ARN long non codificante (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisens RNA 1 (DARS-AS1) hè direttamente implicatu in l'inibizione di a via PACT-PKR è prumove a proliferazione di e cellule cancerose.Utilizendu u screening funzionale à grande scala di lncRNA associatu à u cancer CRISPRi 971, avemu trovu chì DARS-AS1 era assuciatu cù una proliferazione di cellule cancerose significativamente aumentata.Dunque, DARS-AS1 knockout inibisce a proliferazione cellulare è prumove l'apoptosi di e cellule cancerose in diverse linee di cellule cancerose in vitro è riduce significativamente a crescita di tumore in vivo.Meccanicamente, DARS-AS1 si lega direttamente à u duminiu di attivazione PACT è impedisce l'interazione PACT-PKR, riducendu cusì l'attivazione di PKR, a fosforilazione di eIF2α, è inibendu a morte di e cellule apoptotiche.Clinicamente, DARS-AS1 hè largamente spressione in parechji cancers, è a sovraespressione di stu lncRNA hè indicativa di un pronostico poveru.Stu studiu elucida a regulazione specifica di u cancer di a via PACT-PKR da DARS-AS1 lncRNA è furnisce un altru scopu per u pronostico è u trattamentu di u cancer.
A capacità di adattà à u stress hè una caratteristica impurtante di a sopravvivenza è a proliferazione di e cellule cancerose.A rapida proliferazione è e caratteristiche metaboliche di u cancru picconu in i microambienti duri - privazione di nutrienti, ipossia è pH bassu - chì ponu innescà e vie di signalazione di morte cellulare.A disregulazione di i geni sensittivi à u stress cum'è p535, proteine ​​​​6, 7, KRAS8, 9, è HIF-110, 11, 12, 13 di scossa di calore hè spessu osservata in u cancer, chì impediscenu l'apoptosi è prumove a sopravvivenza.
A protein kinase R (PKR) hè un impurtante sensore di stress è subunità kinase di u fattore d'iniziu eucarioticu 2α (eIF2α), un regulatore di traduzzione chì liga u stress cellulare à a morte cellulare.PKR hè stata urigginariamente identificata cum'è una proteina antivirale da a rilevazione di un RNA stranieru a doppia catena (dsRNA).Dopu l'attivazione, PKR fosforila eIF2α per inibisce a sintesi di proteina virali è cellulare14,15,16.PACT (proteina attivatore PKR) hè stata identificata cum'è a prima proteina attivatore PKR in assenza di dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Attraversu l'interazzione diretta cù PKR, PACT trasduce diversi stress (fame di serum, trattamentu di perossidu o arsenite) à PKR è camini di signalazione downstream.In più di a fosforilazione di eIF2α, l'attivazione di PKR mediata da PACT attiva diversi avvenimenti assuciati à a risposta di stress, cumpresu u statu redox alteratu via a via PI3K / Akt24, a verificazione di danni à l'ADN rinfurzata via p5325,26 è NF-κB27,28 Regula a trascrizione, 29. Data u so rolu criticu in a risposta di stress, a proliferazione, l'apoptosi è altri prucessi cellulari chjave, PKR è PACT sò miri terapeutici promettenti per parechje malatie, in particulare u cancer30,31,32,33.In ogni casu, malgradu questu significatu funziunale è biologicu pleiotropicu, a regulazione di l'attività PACT / PKR in e cellule cancerose resta sfuggente.
LncRNAs sò trascrizioni più grande di 200 nucleotidi senza potenziale di codificazione di proteine.Siccomu i prughjetti di sequencing di u genoma interu di punta anu identificatu migliaia di lncRNA,35,36 assai sforzu hè statu fattu per elucidare e so funzioni biologiche.Un corpu crescente di ricerca hà dimustratu chì lncRNAs sò implicati in parechji prucessi biologichi37 cumprese a regulazione di l'inattivazione di u cromosoma X38,39, l'imprinting40, a trascrizione41,42, a traduzzione43 è ancu a crescita di u cancer44,45,46,47.Questi studii anu infurmatu chì parechji lncRNA sò implicati in a via PACT / PKR.Un tali studiu hà dimustratu chì lncRNA ASPACT inibisce a trascrizione PACT è aumenta a retenzioni nucleari di PACT mRNA.Altri studii anu dimustratu chì lncRNA nc886 si unisce à PKR è impedisce a so fosforilazione49,50.Finu a ora, lncRNA chì regula l'attivazione PKR mediata da PACT ùn hè micca statu infurmatu.
Aspartyl-tRNA synthetase RNA antisensu 1 (DARS-AS1) hè statu identificatu cum'è un lncRNA oncogenic51,52,53,54.Per mezu di a regulazione di miP-194-5p53, miP-12952 è miP-532-3p51, DARS-AS1 hè statu dimustratu per prumove a crescita di carcinoma di cellule renali, carcinoma di tiroide è carcinoma di pulmone non-small cell, rispettivamente.Tong è i culleghi anu ancu truvatu chì DARS-AS1 prumove a progressione di mieloma mantenendu a stabilità di a proteina 39 (RBM39) RNA-binding motif.In ogni casu, nisun studiu hè statu fattu nantu à se stu lncRNA hè implicatu in a regulazione di l'attivazione PACT-PKR è a risposta di stress di e cellule cancerose.
Quì, avemu realizatu una schermu di perdita di funzione à grande scala utilizendu u sistema CRISPRi è determinatu chì DARS-AS1 lncRNA prumove a proliferazione di parechji tipi di cellule cancerose.Inoltre, avemu identificatu un mecanismu maiò: DARS-AS1 si lega direttamente à PACT, inibisce u PACT è PKR, impedisce a fosforilazione di eIF2α, un sustrato PKR più bassu, è infine inibisce a morte di e cellule apoptotiche.In cunclusioni, u nostru travagliu revela u lncRNA DARS-AS1 cum'è un regulatore di a via PACT-PKR è un target potenziale per u trattamentu è u pronostico di u cancer.
Studi di profilazione genomica estensiva anu identificatu centinaie di lncRNA assuciati à u cancer.Tuttavia, a so funzione resta largamente scunnisciuta56.Per identificà i candidati promettenti di lncRNA implicati in a progressione di u cancer, avemu realizatu una schermu di perdita di funzione per a proliferazione ridutta in a linea di cellula di u cancer colorectal SW620 utilizendu u sistema CRISPRi (Fig. 1a).A caratteristica unica di e linee di cellule di cancro di colon SW480 è SW620 hè chì sò derivati ​​​​da tumori primari è secundarii in un solu paziente.Questu furnisce un paragone preziosu per studià i cambiamenti genetichi in a progressione di u cancer di u colon avanzatu.Dunque, avemu analizatu i transcriptomi di e linee di cellule di cancro colorettale (SW480 è SW620) utilizendu a sequenza di l'RNA è raccolte alcuni lncRNA funzionali potenziali da a literatura publicata.Basatu annantu à questi risultati, avemu disignatu una biblioteca di sgRNA cumulata chì cuntene 7355 oligos sgRNA destinati à 971 lncRNA associati à u cancro è 500 oligos sgRNA senza mira per un cuntrollu negativu (Dati Supplementari 1).
Rappresentazione schematica di screening cù u sistema CRISPRi.b arricchimentu di sgRNA dopu a screening.A linea punteggiata orizontale rapprisenta log2 (cambio di volte) = ± 0,58.La ligne pointillée verticale indique p valeur = 0,05.I punti neri rapprisentanu sgRNA non-target (designatu NC).I punti rossi sò sgRNA destinati à DARS-AS1.I punti blu sò sgRNA destinati à LINC00205, un lncRNA oncogenicu descritto prima.fold change = (lectura nurmalizata, ghjornu 17)/(lectura nurmalizata, ghjornu 0).c L'abbattimento di sgRNA DARS-AS1 inibisce la crescita cellulare.E barre d'errore rapprisentanu ± deviazione standard di i trè esperimenti.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 test t di Student à dui coda.d Espressione DARS-AS1 in i tumori (set di dati TCGA).em Espressione di DARS-AS1 in campioni nurmali è tumorali accoppiati da pazienti cù BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP è COAD, rispettivamente (set di dati TCGA).I valori p sò stati ottenuti aduprendu u test t di Student à dui coda.
Dopu avè custruitu u plasmide è imballatu u lentivirus, avemu trasduciutu a linea di cellule di cancro colorectal dCas9-SW620 cù a libreria sopra in quattru esperimenti di infezzione indipendenti.A multiplicità di l'infezzione (MOI) per queste infizzioni era 0.1-0.3, chì indica chì ogni cellula pò esse trasfettata solu cù un sgRNA.Dopu à 18 ghjorni di cultura in vitro, u prufilu di arricchimentu di sgRNAs di destinazione diminuite o aumentate dopu à u screening, mentre chì u numeru di oligonucleotidi di cuntrollu non-targeted hè statu relativamente invariatu cumparatu cù u prufilu di pre-screening, chì indicanu chì u nostru target hà una schermu altamente specificu. biblioteca.Risu.1b è tabella supplementaria 1). LINC00205, chì hè statu infurmatu prima per prumove u cancer di pulmone è a progressione di u cane di fegatu 58,59,60, hè stata screened out (log2 (foldchange) <-0.58, p value <0.05), cunfirmendu l'affidabilità di sta screening (Fig. 1b). LINC00205, chì hè statu infurmatu prima per prumove u cancer di pulmone è a progressione di u cane di fegatu 58,59,60, hè stata screened out (log2 (foldchange) <-0.58, p value <0.05), cunfirmendu l'affidabilità di sta screening (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, rapprisintatu prima di prumove a prugressioni di u cancer di pulmuniu è u cane di fegatu 58,59,60, hè stata esclusa (log2 (fold change) <-0.58, p-value <0.05), cunfirmendu a robustezza di sta screening (Fig. .1b) . Linc0020 之前 被 报道 肝癌 进展 58,59.60, 被 筛筛 掉 (了 筛) <-0.58, P 值 <0.05), 了 了 了 筛选 的 可靠性 (图 1B). Linc0020 之前 被 报道 肝癌 进展 58,59.60, 被 筛筛 掉 (了 筛) <-0.58, P 值 <0.05), 了 了 了 筛选 的 可靠性 (图 1B). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, infurmatu previamente per prumove a progressione di u cancer di pulmone è di fegatu 58,59,60, hè stata esclusa (log2 (cambiamentu di volte) <-0.58, p-value <0.05), cunfirmendu a robustezza di sta screening (Fig. .1b).
Trà tutti i lncRNAs pruvati, DARS-AS1 hè statu ancu screened, cù i trè oligonucleotidi di sgRNA cognate significativamente ridotti dopu à 18 ghjorni di cultura, chì suggerenu chì u knockdown of this lncRNA resulted in ridutta proliferazione di u cancer (Fig. 1b).Stu risultatu hè statu ancu sustinutu da l'analisi MTS in e cellule di cancro colorettale chì mostra chì u ritmu di crescita di e cellule di knockdown DARS-AS1 era solu dimezzatu cumparatu cù e cellule di cuntrollu (Figura 1c) è era coherente cù i rapporti precedenti di parechji altri tipi di cancro.: cancru di reni di cellula chjaru, cancru di tiroïde è cancru di pulmone non-small cell51,52,53,55.Tuttavia, a so funzione è i meccanismi moleculari in u cancer colorectal restanu inesplorati.Dunque, avemu sceltu questu lncRNA per un studiu più.
Per studià l'espressione DARS-AS1 in i pazienti, avemu analizatu in modu cumpletu 10,327 campioni di tumore da u prughjettu di l'Atlas di u Genoma di Cancer (TCGA).I nostri risultati mostranu chì DARS-AS1 hè largamente espresso è significativamente upregulated in cellule sane in una varietà di tumuri, cumpresu l'adenocarcinoma di u colon (COAD), u carcinoma di cellule clear renali (KIRC) è u carcinoma di cellule papillari renali (KIRP)..Assai pocu (Fig. 1d è Supplementary Fig. 1a, b). L'analisi di campioni sani / tumorali accoppiati hà cunfirmatu ancu una espressione significativamente più alta di DARS-AS1 in i tumuri di carcinoma uroteliale di a vescica (BLCA), carcinoma a cellule chiare renali (KIRC), adenocarcinoma di prostata (PRAD), carcinoma a cellule squamose pulmonari (LUSC). , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), pulmon adenocarcinoma (LUAD), liver hepatocellular carcinoma (LIHC), kidney renal papillary cell carcinoma (KIRP) è adenocarcinoma colon (COAD) (p value <0.05) (Fig. 1e-m) . L'analisi di campioni sani / tumorali accoppiati hà cunfirmatu ancu una espressione significativamente più alta di DARS-AS1 in i tumuri di carcinoma uroteliale di a vescica (BLCA), carcinoma a cellule chiare renali (KIRC), adenocarcinoma di prostata (PRAD), carcinoma a cellule squamose pulmonari (LUSC). , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), pulmon adenocarcinoma (LUAD), liver hepatocellular carcinoma (LIHC), kidney renal papillary cell carcinoma (KIRP) è adenocarcinoma colon (COAD) (p value <0.05) (Fig. 1e-m) .L'analisi di campioni sani / tumorali accoppiati hà ancu cunfirmatu l'espressione significativamente più alta di DARS-AS1 in carcinoma uroteliale di a vescica (BLCA), carcinoma di cellule renali è renali (KIRC), adenocarcinoma di prostata (PRAD), carcinoma squamous di pulmone (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , carcinoma endometriale di u corpus uteri (UCEC), adenocarcinoma di u pulmone (LUAD), carcinoma hepatocellulare di u fegatu (LIHC), carcinoma di cellule papillari di u reni (KIRP), è adenocarcinoma di u colon (COAD) (valeur p < 0,05) (Fig. 1e- m) .配对配对 / 肿瘤样本 的 分析分析 一步 了 Ders ders 在 膀胱膀胱膀胱 上 (Biancu), 在肾 V透明 细胞癌 (KIRC), 肺鳞状前列 (PRAD), 肺鳞状前列 (PRAD), 肺鳞状前列 (PRAD), V肺鳞状肺鳞状 (PRAD), 肺鳞状前列 (PRAD), V肺鳞状肺鳞状 (PRAD), 肺鳞状前列 (LIANC), 肺鳞状前列 (PRAD), V肺鳞状肺鳞状 (PRAD), 肺鳞状前列 (PRAD), V肺鳞状肺鳞状 (PRAD), 肺鳞状前列 (PRAD), V肺鳞状前列 (PRAD), V肺鳞状肺鳞状 (PRAD), 肺鳞状前列 (LIAC) 肿瘤肿瘤 (Lusc) 肿瘤肿瘤 中 的显着 更 高, 子宫体子宫子宫体子宫 癌 (Ucec), 肺腺癌 (luad), 肺腺癌 (lAAD), 肺腺癌肝肝 (lib), 肾肾 乳头状乳头状细胞癌 (KirP) 和结肠腺癌 (POAD) 和结肠腺癌 (POAD )和结肠腺癌 (POAD) (P 值<0,05）（图1e-m） .配 对对 / 肿瘤样本对 的 分析分析 了 dars-OS1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 在 上, T肾 肾细胞癌前列 V腺腺癌 (Prad), 细胞癌细胞癌(Lusc) 肿瘤 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中, 内膜内膜 更更 表达, 内膜内膜 更 ((luhc) 肝肝肾 (Lihc) 肾肾 (Lihc) 肾细胞癌 (Lihc) 肾肾 (Lihc) 肾肾 (Lihc) 肾细胞癌 (Lihc) 肾细胞癌 (Lihc) 肾肾 (Lihc) 肾细胞癌 (Lihc) 肾肾 (Lib) 肾肾癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .L'analisi di campioni sani/tumorali accoppiati hà ancu sustinutu u rolu di DARS-AS1 in carcinoma uroteliale di a vescica (BLCA), carcinoma a cellule renali a cellule chiare (KIRC), adenocarcinoma di prostata (PRAD) è tumuri di carcinoma a cellule squamose pulmonari (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). expression in corpus uterine carcinoma (UCEC), adenocarcinoma pulmonar (LUAD), carcinoma hepatocellular (LIHC), carcinoma di cellule papillari renali (KIRP) è adenocarcinoma di u colon (COAD) (valore p <0.05) (Figura 1e -m).Inseme, sti risultati indicanu chì DARS-AS1 hè largamente è altamente spressione in una varietà di cancers.
Perchè DARS-AS1 è DARS (u genu chì codifica u filu antisensu) sparte u stessu promotore è si trovanu à fiancu à l'altru, avemu designatu shRNA per chjappà specificamente DARS-AS1 ma micca DARS (Figura Supplementaria 2a, b è Tabella Supplementaria 2) .In più di SW620, avemu usatu ancu trè altre linee cellulari chì esprimenu assai DARS-AS1 per studià l'efficacità è a funzione di shRNA knockdown (Tabella Supplementaria 3).I nostri risultati indicanu chì tutti i trè shRNA sviluppati anu ottenutu almenu 80% di efficienza di knockdown DARS-AS1 cù pocu effettu nantu à a quantità di DARS mRNA (Figura supplementaria 2c-f).Inoltre, avemu truvatu chì u knockdown di DARS-AS1 cù questi shRNAs hà inibiti significativamente a crescita di e cellule in e linee di cellule di cancro colorectal SW620 (49.7%) è HCT116 (27.7%), a linea di cellula di cancro di u pettu MBA-MD-231 (53.4%).) è a linea di cellula di l'hepatoma HepG2 (92,7% di riduzzione), è ancu a so capacità di furmà sferii unanchored (reduzzione media di ~ 50,8%, 44,6%, 40,7% è 75,7% per linea di cellula) (Fig. 2a, b).In SW620, i risultati di l'assay di furmazione di a culunia anu cunfirmatu ancu chì u shRNA DARS-AS1 hà impeditu significativamente a proliferazione cellulare cù una diminuzione media di circa 69,6% (Fig. 2c).
Effettu di u cuntrollu shRNA è DARS-AS1 shRNA nantu à a proliferazione cellulare (a) è a furmazione di sferoidi (b) in cellule SW620, HCT116, MBA-MD-231 è HepG2.c Effettu di u cuntrollu shRNA è DARS-AS1 shRNA nantu à a furmazione di colonie in cellule SW620.Proliferazione cellulare (d), formazione di sferoidi (e) e formazione di colonie (f) di cellule SW620 che sovraesprimono DARS-AS1.I dati mostrati sò a media ± deviazione standard di trè esperimenti.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, è *** p ≤ 0,001 da u test t di Student à dui coda.
Per cumplementarii studii di perdita di funziunamentu, avemu creatu dopu cellule SW620 overexpressing DARS-AS1 (Supplementary Fig. 2g).L'overexpression DARS-AS1 hà aumentatu significativamente a crescita di e cellule (1,8 volte), a furmazione di sferoidi unanchored (1,4 volte) è a furmazione di colonie (3,3 volte) in e cellule SW620 (Fig. 2d-f).Avemu cunfirmatu stu risultatu utilizendu una altra linea di cellula chì esprime DARS-AS1, A549.Questa proliferazione cellulare rinfurzata per via di a sovraespressione DARS-AS1 hè stata osservata in più in e cellule A549 (Figura Supplementaria 2h, i è Tabella Supplementaria 3).Pigliati inseme, sti studii di guadagnu è perdita dimustranu chì DARS-AS1 prumove a proliferazione di cellule cancerose in vitro.
Per spiegà u mecanismu sottostante da quale DARS-AS1 regula a proliferazione cellulare, avemu realizatu un'analisi di pull-down di RNA per identificà i so potenziali partenarii di legame à a proteina.I risultati di RT-qPCR anu dimustratu chì circa 86.2% di DARS-AS1 hè situatu in u citoplasma di e cellule SW620 (Figura Supplementaria 3a).I DARS-AS1 o pseudoRNA biotinilati trascritti in vitro sono stati poi incubati con lisati di cellule SW620 seguiti da separazione SDS-PAGE.A tintura d'argentu sussegwente hà dimustratu chì una banda distinta (~ 38 kDa) hè stata arricchita significativamente in DARS-AS1 pull samples ma micca in dummy RNA o beads samples (Fig. 3a).Questa banda hè stata identificata cum'è una proteina attivante PKR (PACT) per spettrometria di massa (MS) è più cunfirmata da immunoblotting in SW620, HCT116, è HepG2 cell lines (Fig. 3a, b).L'arricchimentu di DARS è di e proteine ​​​​PACT correlate - PKR è TRBP - hè statu ancu investigatu cù l'analisi di RNA da Western blotting (WB).I risultati indicanu chì nisuna interazzione diretta trà DARS-AS1 RNA è sti trè proteini hè stata trovata (Figura supplementaria 3b).L'interazzione specifica trà DARS-AS1 è PACT hè stata ulteriormente cunfirmata da l'analisi di immunoprecipitazione di RNA (RIP), chì hà dimustratu chì DARS-AS1 hè stata arricchita significativamente in anticorpi anti-PACT ma micca altri RNA di cuntrollu (Figura 3c).Per determinà se DARS-AS1 interagisce direttamente cù PACT in assenza di altri cumpunenti cellulari, un test di interferometria in vitro biolayer (BLI) hè statu realizatu utilizendu PACT purificatu.DARS-AS1 o RNA fittiziu marcatu cù biotina hè stata immobilizzata nantu à biosensori di streptavidina (SA) è poi incubata in un buffer cineticu chì cuntene 1 μM PACT.In particulare, PACT hà ligatu fortemente à DARS-AS1 (valore KD ~ 26,9 nM), ma micca per imite l'RNA (Figura 3d).Inseme, questi risultati dimostranu una interazione diretta è una alta affinità trà DARS-AS1 è PACT.
L'analisi di pull RNA identificò DARS-AS1 chì interagisce cù PACT in cellule SW620.Sopra, tintura d'argentu di proteini rilativi.I immunoblots più bassi sò stati realizati cù l'anticorpu anti-PACT.b L'analisi di pull-down di l'RNA hè stata realizata in cellule HCT116 (in cima) è HepG2 (in fondu).L'arricchimentu PACT hè statu rilevatu da immunoblotting.I saggi di immunoprecipitazione di cRNA (RIP) sò stati realizati in cellule SW620 cù l'anticorpi indicati.d Les courbes de liaison PACT à DARS-AS1 à pleine longueur ou à l'ARN de contrôle ont été obtenues grâce à l'interférométrie biolayer (BLI).L'RNA hè stata immobilizzata nantu à un biosensore di streptavidina.1 μM PACT hè stata utilizata per misurà l'associazione.L'essai d'extraction de l'ARN a été effectué à l'aide de DARS-AS1 pleine longueur biotinilé ou tronqué (en haut).Immunoblot chì mostra PACT ricevutu (in fondu).f Le PACT signalé purifié a été incubé avec DARS-AS1 pleine longueur biotinilé ou tronqué (comme dans e) pour l'essai RIP in vitro.L'RNA estratto hè verificatu da RT-qPCR.g L'affinità relativa di diversi frammenti di RNA per PACT hè stata ottenuta cù l'interferometria di biolayer.Per l'analisi, 100 nM RNA è 1 μM RAST sò stati utilizati.h Les essais RIP in vitro ont été effectués à l'aide de PACT étiqueté intact ou tronqué purifié.L'RNA estratto hè verificatu da RT-qPCR.i Tasso di crescita di e cellule SW620 sovraesprimente DARS-AS1, PACT, o i dui.j Overexpression of full-length or truncated DARS-AS1 in cells SW620 hà avutu effetti diffirenti nantu à a crescita cellulare.k Apoptosi hè stata rilevata da immunoblotting cù anticorpi anti-PARP.l Knockout di DARS-AS1 induce l'apoptosi di e cellule SW620 cum'è mostratu da a citometria di flussu.I dati mostrati sò a media ± deviazione standard di trè esperimenti. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, per test t di Student à dui coda. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, per test t di Student à dui coda. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 da u test t di Student à dui coda. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 da u test t di Student à dui coda.
Dopu avemu generatu trè frammenti di RNA DARS-AS1 biotinilati per trascrizione in vitro per identificà a regione DARS-AS1 necessaria per l'associazione PACT (Figura 3e).I risultati di l'analisi di l'RNA dimustranu chì ogni frammentu era capaci di interagisce cù PACT, ma a regione 3′-terminale (384-768 nucleotides labelled A3) mostrò più di 1-384 nucleotides marcati A1) (Fig. 3e).I risultati simili sò stati osservati in u test RIP in vitro cù PACT recombinante (Figura 3f).In cunfurmità cù questi risultati, esperimenti per ligà frammenti di RNA immobilizzati à PACT cù BLI anu ancu dimustratu chì PACT hà una affinità più alta per A3 (384-768 nt) (valore KD di circa 94,6 nM), mentre chì quasi nisuna ligame cù altre aree.(Fig. 3d).
Avemu ancu esaminatu e regioni di ubligatoriu assuciati in PACT.PACT cuntene trè duminii funzionali, dui di i quali sò cunservati domini di RNA-binding double-stranded (dsRBD) è un terzu duminiu (designatu D3) chì agisce cum'è attivatore di l'interazzione di prutezione.Per esaminà a capacità di ubligatoriu di lncRNA di ogni duminiu, avemu ingegneriatu trè mutazioni chì sguassate ognuna di i trè domini è eseguitu un test RIP in vitro.I nostri risultati dimustranu chì l'eliminazione di u terzu duminiu (D3) di PACT hà riduciutu significativamente a so interazzione cù DARS-AS1 (da 0,11 volte in paragunà cù PACT intactu) cumparatu cù l'altri dui mutazioni (Fig. 3h), hè statu dimustratu chì a liberazione. di D3 interagisce cù DARS.-AC1.Inseme, questi risultati suggerenu chì l'interazzione trà DARS-AS1 è PACT pò esse principarmenti attraversu l'estremità 3' di DARS-AS1 è u duminiu D3 di PACT.
Avemu nutatu chì DARS-AS1 ùn hà micca effettu nantu à l'espressione PACT è PACT ùn hà micca effettu nantu à DARS-AS1 (Figura Supplementaria 3c).Dopu avemu esaminatu l'effettu di u PACT knockdown nantu à a crescita cellulare.In cuntrastu à DARS-AS1, e cellule relative criscenu 1,5-3 volte più veloce quandu PACT hè statu abbattutu (Figura supplementaria 3d).I risultati di l'assay di furmazione di culunia indicanu chì e cellule formanu culunie 2-3-fold dopu u trattamentu shRNA cù PACT (Figura Supplementaria 3e).Per pruvà se DARS-AS1 regula a proliferazione cellulare per mezu di PACT, avemu generatu cellule SW620 chì sovraesprimenu PACT, DARS-AS1, o i dui.A sovraespressione di PACT hà dimustratu una inibizione significativa di a proliferazione cellulare (Figura 3i).Mentre chì a sovraespressione di DARS-AS1 per se hà prumuvutu significativamente a proliferazione di e cellule, ùn ci era micca una differenza significativa in u ritmu di crescita di e cellule chì sovraesprimenu DARS-AS1 è PACT.Questi risultati suggerenu chì PACT pò contru à a proliferazione aumentata causata da a sopraespressione DARS-AS1.
Siccomu e diverse regioni di DARS-AS1 anu diverse capacità di legame PACT, avemu investigatu a so influenza relativa nantu à a proliferazione cellulare da una diversa sopraespressione di frammenti DARS-AS1.Comparatu à l'altri dui frammenti, DARS-AS1 era overexpressed at the 3′ end (384-768 nt), a regione principale PACT-related in DARS-AS1, chì hà avutu a più alta capacità per stimulà a proliferazione cellulare (Fig. 3j).Questi risultati indicanu una correlazione positiva trà a capacità di ubligatoriu è a funzione biologica di DARS-AS1.
PACT hè statu rapportatu per esse una proteina pro-apoptotica19.Dunque, avemu investigatu l'effettu di DARS-AS1 nantu à l'apoptosi.Cum'è l'aspittava, u knockdown di DARS-AS1 hà aumentatu significativamente a clivatura di PARP in i celluli SW620 è hà aumentatu a proporzione di cellule annexin V-positive in SW620, HCT116, HepG2 è MBA-MD-231 cell lines (Fig. 3k).3).3f-h), chì indica chì l'effettu anti-apoptoticu di DARS-AS1 in e cellule cancerose hè oppostu à a funzione induce l'apoptosi di PACT.Inseme, questi risultati suggerenu chì u mecanismu di a funzione oncogenica DARS-AS1 pò esse attraversu l'inibizione di a funzione PACT.
Dopu, avemu esploratu l'implicazioni funziunali di l'associazione DARS-AS1-PACT.PACT hè statu rapportatu per attivà PKR per interazzione diretta, chì successivamente aumenta a fosforilazione di eIF2α, pruvucannu l'eliminazione traduzionale è l'apoptosi17.Prima, avemu esaminatu se DARS-AS1 affetta a localizazione cellulare di PACT è PKR.A microscopia di fluorescenza cunfocale hà dimustratu chì PACT è PKR sò stati altamente colocalizzati in cellule SW620 cun un coefficientu mediu di correlazione Pearson di 0,72.Intantu, a sovraespressione DARS-AS1 hà riduciutu significativamente a co-localizzazione di PACT è PKR (coefficient di correlazione Pearson mediu 0.61) (Figura 4a).Per investigà se DARS-AS1 puderia modulà l'interazione PACT-PKR, avemu realizatu un test di co-immunoprecipitation (co-IP) cù anticorpi anti-PACT in lisati di cellule SW620.PKR hè stata assai arricchita in anti-PACT in i celluli di cuntrollu, mentri a ricuperazione di PKR hè stata ridutta significativamente in lisati da e cellule overexpressing DARS-AS1 (Fig. 4b).PACT è PKR purificati marcati sò stati utilizati per i saggi di legame di proteine ​​​​in vitro.In cunsiquenza, quelli chì furnianu DARS-AS1 ma senza RNA di cuntrollu anu mostratu l'interazione PACT-PKR suppressa (Figura 4c).Tutti i risultati anu dimustratu chì DARS-AS1 hà disturbatu a cumunicazione PACT è PKR.
una Co-localizzazione di PACT è PKR in e cellule di cuntrollu o di cellule sovraesprimente DARS-AS1 hè stata osservata cù a microscopia di fluorescenza confocale.I nuclei sò stati macchiati cù DAPI.I risultati statistichi sò stati ottenuti da 16 ritratti.b Co-immunoprécipitation (co-IP) à l'aide d'anticorps anti-PACT dans les lisés cellulaires de cellules SW620 de contrôle ou de cellules qui surespriment DARS-AS1.c PACT marcatu, PKR purificatu è trascrittu in vitro cù DARS-AS1 o mock RNA sò stati incubati per l'analisi in vitro di legame di proteine.Anticorpi anti-bandiera sò stati utilizati per immunoprecipitation.d Immunoblots cù l'anticorpi indicati sò stati realizati in cellule SW620 è HCT116 trasfettate cù shRNA di cuntrollu o DARS-AS1-shRNA seguitu da a fame di serum.I livelli di espressione di DARS-AS1 alteranu a sensibilità cellulare à thapsigargin.E cellule SW620 sò state trasfettate cù shRNA DARS-AS1, plasmide di sovraespressione DARS-AS1 o plasmide di cuntrollu.E cellule sò state trattate cù thapsigargin per 48 ore è a viabilità cellulare hè stata determinata cù u reattivu MTS.f DARS-AS1 trascritto in vitro o RNA fittizio e PACT purificato sono stati usati per l'analisi di attivazione in vitro e la rilevazione di immunblot.g Immunoblots chì utilizanu questi anticorpi sò stati eseguiti nantu à e cellule SW620-ctrl (a sinistra) o à e cellule chì sopraesprimenu mutanti PKR (a destra).Queste cellule sò state poi trasfettate cù shRNA di cuntrollu o DARS-AS1-shRNA seguita da a fame di serum.h A citometria di flussu hà dimustratu chì l'inattivazione di u PKR mutante cumpensu l'apoptosi indotta da DARS-AS1 in e cellule SW620.i Immunoblots cù l'anticorpi indicati sò stati realizati in cellule SW620 (a manca) o HCT116 (a diritta).E cellule trasfettate cù shRNA di cuntrollu o DARS-AS1 shRNA sò private di serum è supplementate cù 100 nM PKR C16 inhibitor o DMSO.Barre d'échelle = 5 µm.I dati mostrati sò a media ± deviazione standard di trè esperimenti.* p ≤ 0,05 test t di Studente à duie code.
Hè generalmente crede chì una volta chì PACT interagisce cù PKR17, a fosforilazione di PKR à Thr451 pò esse indotta.I nostri risultati indicanu chì u nivellu di fosforilazione PKR era significativamente elevatu in i celluli di knockdown DARS-AS1 dopu a fame di serum (Fig. 4d è Supplementary Fig. 4a).In cunsiquenza, truvamu chì a fosforilazione di eIF2α, u sustrato principale di PKR, hè stata ancu aumentata significativamente da DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d è Supplementary Fig. 4a).Thapsigargin hè un stressor ER chì face chì l'ER libera Ca2+.U trattamentu cù thapsigargin hè statu infurmatu per induce l'espressione è l'attivazione di PACT, chì più interagisce cù è attivate PKR, purtendu à l'apoptosi aumentendu a fosforilazione di eIF2α 18,61.Quì, avemu usatu thapsigargin cum'è stimulatore di a via PACT / PKR per investigà se DARS-AS1 pò aiutà e cellule à superà u stress inibendu a via PACT / PKR.Avemu osservatu chì u livellu di l'espressione DARS-AS1 correlated positivamente cù a resistenza cellulare à thapsigargin.I celluli SW620 overexpressing DARS-AS1 survived better when treated with thapsigargin, mentri cells with DARS-AS1 knockdown diventenu più suscettibile (Fig. 4e).In cunfurmità cù questi risultati, a sovraespressione DARS-AS1 riduce a fosforilazione PKR indotta da thapsigargin (Figura supplementaria 4b).In cuntrastu, dopu à u trattamentu di thapsigargin, PKR è eIF2α sò stati fosforilati in una misura più altu in i celi di knockdown DARS-AS1 cumparatu cù e cellule di cuntrollu (Figura supplementaria 4b).Curiosamente, thapsigargin induce l'espressione DARS-AS1 in modu dipendente da a dosa, chì pò indicà una funzione anti-stress di DARS-AS1 (Figura supplementaria 4c).Inoltre, avemu realizatu analisi di attivazione in vitro per cunfirmà queste osservazioni.In breve, a PKR hè stata purificata da i lisati di cellule cù un anticorpu anti-PKR, dopu incubatu cù PACT recombinante è DARS-AS1 trascritti in vitro.Dopu a reazione enzimatica, u fosfo-PKR hè statu rilevatu cù WB.I nostri risultati indicanu chì a fosforilazione di PKR hè stata significativamente inibita da DARS-AS1, ma micca da RNA di cuntrollu (Figura 4f).Questi risultati in vitro è in vivo suggerenu chì DARS-AS1 inibisce l'attivazione PKR mediata da PACT.À u listessu tempu, avemu ancu osservatu una diminuzione di a ricuperazione di PACT in presenza di DARS-AS1 (Figura 4f).Stu risultatu hè coherente cù i risultati di l'analisi in vitro di legame di proteine ​​​​(Figura 4c) è illustra dinò a funzione di bloccu di DARS-AS1 per l'associazione PACT-PKR.
Ser246 è Ser287 in u duminiu D3 di PACT sò richiesti per l'attivazione di PKR sottu stress cellulare.A sustituzione di dui residui di serina per l'alanina hà datu PACT mutante (mutD), chì hà attivatu PKR in l'absenza di stress, è a sostituzione per l'alanina (mutA) hà invertitu u protocolu.Siccomu avemu dimustratu l'impurtanza di stu duminiu in associazione diretta cù DARS-AS1, avemu generatu questi dui mutanti PACT per pruvà se sti residui puderanu ancu esse implicati in l'interazzione cù DARS-AS1.Curiosamente, i dui mutanti anu persu l'abilità di unisce à DARS-AS1 (Figura Supplementaria 4d), chì suggerenu chì a struttura completa di a proteina PACT pò esse necessaria per l'interazzione efficace cù DARS-AS1.
Inoltre, i nostri risultati suggerenu ancu chì l'inibizione indotta da DARS-AS1-shRNA di a proliferazione cellulare pò esse restaurata parzialmente per esprimere un mutante PACT negativu dominante (PACTmutA) o un mutante PKR negativu dominante (PKRmut) (Figura supplementaria 4e. e).Overexpression of dominant-negative PKR mutants reduced PKR phosphorylation induced by DARS-AS1 knockdown as well as eIF2α phosphorylation in cells serum-prived (Fig. 4g).A più impurtante, a proporzione di e cellule apoptotiche induce da DARS-AS1 knockdown hè stata ancu ridutta in i celluli chì sopraesprimenu PKRmut (Fig. 4h è Supplementary Fig. 4g).Inhibition of PKR kinase activity also impairs DARS-AS1 function, cum'è i risultati dimustranu chì DARS-AS1 knockdown raramente attivatu a fosforilazione di PKR è eIF2α quandu e cellule sò state trattate cù un inhibitore C16 specificu di PKR (Fig. 4i è Supplementary Fig. 4h).).Inseme, i nostri risultati suggerenu chì DARS-AS1 prumove a proliferazione cellulare, almenu in parte, inibendu l'attivazione PKR mediata da PACT.
Per scopre più u rolu di DARS-AS1 in a tumogenesi, avemu realizatu esperimenti in vivo cù un mudellu di xenograft di mouse. I risultati mostranu chì u knockdown di DARS-AS1 hà diminuitu dramaticamente a crescita di tumore in i topi (p value <0.0001) (Fig. 5a). I risultati mostranu chì u knockdown di DARS-AS1 hà diminuitu dramaticamente a crescita di tumore in i topi (p value <0.0001) (Fig. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значе,н000.15). I risultati mostranu chì u knockdown di DARS-AS1 riduce drasticamente a crescita di tumore in i topi (valore p <0,0001) (Figura 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей у мышей 0.5 (зни0 0.5). I risultati anu dimustratu chì u knockdown di DARS-AS1 riduce significativamente a crescita di tumore in i topi (valore p <0,0001) (Figura 5a).Cusì, in u gruppu di knockdown DARS-AS1, ci era una diminuzione significativa di u voluminu mediu di tumore da circa 72.9% è a massa tumorale media di circa 87.8% (Figura 5b-d).Questi risultati suggerenu fermamente chì DARS-AS1 pò prumove significativamente a crescita di tumore in vivo.
Effetti di l'annullamentu di l'annunziu DARS-AS1 nantu à l'oncogenesi colorectal in topi nudi.Curve di crescita (a), dimensione di tumore (b), pesu (c) è imagine di tumore (d).E barre d'errore rapprisentanu ± SEM. n = 10. ****p < 0,0001, da u test t di Student's two-tailed. n = 10. ****p < 0,0001, da u test t di Student's two-tailed. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 test t di Studente à dui coda.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. **** p < 0,0001 test t di Studente à duie code.e Kaplan-Meier analizò a correlazione trà i livelli di espressione DARS-AS1 è a sopravvivenza generale in i malati cù UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM è LGG.Alti livelli di espressione DARS-AS1 in i pazienti eranu in u top 50%;u livellu bassu di l'espressione DARS-AS1 in i pazienti era in u fondu 50%.I valori p sò stati determinati utilizendu a prova di classificazione di log.f Mudellu prupostu in quale DARS-AS1 regula a via PACT-PKR è a crescita di tumore.
Per capisce megliu l'impattu clinicu di DARS-AS1, avemu esaminatu a correlazione trà a so espressione è a sopravvivenza di i pazienti.Analizendu u dataset TCGA, truvamu chì l'espressione più alta di DARS-AS1 era assuciata cù melanoma uveale (UVM), cromofobia renale (KICH), carcinoma di cellule papillari renali (KIRP), mesotelioma (MESO), multiplex.A sopravvivenza più bassa hè stata assuciata significativamente cù a morfosi di glioblastoma (GBM) è i pazienti cun glioma cerebrale di bassa qualità (LGG) (Figura 5e).Questi risultati suggerenu chì DARS-AS1 pò ghjucà un rolu impurtante in a progressione tumorale clinica è pò esse un biomarcatore predittivu potenziale in parechji cancers.
In questu studiu, utilizendu un screening funzionale CRISPRi à grande scala, avemu determinatu chì DARS-AS1 lncRNA supera u stress di e cellule cancerose regulendu dui rispunsevuli di stress chjave, PACT è PKR.Per interazzione direttamente cù PACT, DARS-AS1 inibite l'attivazione di PKR mediata da PACT, impediscendu cusì a morte di e cellule apoptotiche è prumove a proliferazione cellulare (Fig. 5f).L'upregulation di DARS-AS1 hè stata osservata in parechji tipi di cancru, chì suggerenu chì a so funzione di prumove a sopravvivenza di e cellule cancerose in cundizioni stressanti pò esse largamente applicabile à parechji tipi di cancru.
PACT hè statu identificatu cum'è una proteina attivatore PKR, è l'attivazione PKR mediata da PACT ghjoca un rolu impurtante in risposti di stress regulendu a trascrizione, a traduzzione, l'apoptosi è altri prucessi cellulari impurtanti62.Per decennii, i tentativi sò stati fatti per capiscenu a regulazione specifica di u cancer di a cascata PACT-PKR.Quì, u nostru studiu hà revelatu un altru meccanismo di regulazione di PACT-PKR in e cellule cancerose per via di lncRNA cellulare DARS-AS1, chì si lega direttamente à PACT, blocca l'interazione PACT-PKR, inibisce l'attivazione di PKR è a fosforilazione di eIF2α, inibendu cusì l'apoptosi indotta da stress è stimulà l'eventuale proliferazione di u cancer.cellule.Questa scuperta mette in luce nantu à i putenziali obiettivi di lncRNA per a prognosi è a terapia di u cancer.
I nostri dati anu dimustratu chì u knockdown di DARS-AS1 sensibiliza e cellule à a fame di serum cun un aumentu significativu di PKR fosforilatu è eIF2α.Questi risultati suggerenu chì DARS-AS1 prumove a sopravvivenza di e cellule cancerose in cundizioni duri inibendu l'attività PACT / PKR.Diversi altri RNAs non codificanti, cum'è ASPACT è nc886, sò ancu implicati in l'assi PACT / PKR per downregulating PACT48 mRNA o regulendu l'autofosforilazione liendu à PKR49,50,64.Frà elli, DARS-AS1 agisce cum'è un disruptor di l'associu PACT-PKR.Stu studiu arricchisce a nostra cunniscenza di a regulazione di l'assi PACT / PKR è u rolu di lncRNA in risposti di stress.
PACT cuntene trè domini separati.Ciascunu di i primi dui dsRBD hè abbastanza per ottene una alta affinità di u PACT à PKR, mentri u terzu duminiu (D3) hè necessariu per l'attivazione di PKR in vitro è in vivo.U nostru studiu hà dimustratu chì DARS-AS1 interagisce preferenzialmente cù u duminiu D3 (Fig. 3h).Data a grande dimensione di lncRNA (768 nucleotidi), l'associazione DARS-AS1 à D3 pò inibisce fisicamente l'interazzione trà u duminiu PACT di dsRBD è PKR, bluccà cusì l'associazione di PACT è PKR.Mutazioni puntuali PACT chì rimpiazzavanu Ser246 è Ser287 in D3 cù alanine o aspartate anu disturbatu a so affinità di legame per DARS-AS1, indicà l'impurtanza di e proprietà strutturali è elettriche di D3 in a so associazione.Ulteriori dettagli di stu mecanismu seranu richiesti in u futuru, utilizendu analisi biochimiche più precise è analisi strutturale PACT d'alta risoluzione.
Studi precedenti anu infurmatu chì DARS-AS1 prumove a proliferazione cellulare per mezu di parechji meccanismi51,52,53.In un esempiu, l'investigatori anu osservatu chì DARS-AS1 hà rigulatu u so gene DARS chì codifica a proteina antisensu mirandu à miP-194-5p in cellule di cancro renale.Tuttavia, in u presente studiu, u knockdown di DARS-AS1 hà avutu pocu effettu nantu à a trascrizzione DARS in parechji tipi di cancru, cumpresu almenu i cancers colorectal, di pettu è di fegatu.Perchè lncRNAs mostranu mudelli d'espressione specifichi di cellule è tissuti, i miccanismi funzionali ùn ponu micca esse cunservati in i tipi di cancru, chì ponu cuntribuisce à questa discrepanza trà e nostre osservazioni è valutazioni precedenti di diversi cancers.Studii spiciali sò necessarii per elucidare i miccanismi specifichi di diversi prucessi fisiologichi è patologichi.
Un analisi di dati clinichi hà dimustratu chì l'espressione DARS-AS1 in i tumuri hè inversamente correlata cù a sopravvivenza di i malati di cancru, chì sottolinea l'impurtanza di l'assi DARS-AS1/PACT/PKR in a prognosi di u cancer.In cunclusioni, u nostru studiu mostra chì DARS-AS1 hè un regulatore di l'assi di signalazione PACT / PKR, prumove a proliferazione di e cellule cancerose, è inibisce l'apoptosi durante a risposta di stress, chì furnisce una altra linea di ricerca è hè d'interessu per a ricerca futura in trattamenti potenziali. .
E linee cellulari umane SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 è HEK293T sò state ottenute da a National Cell Line Resource Infrastructure in Cina.Tutte e cellule sò stati mantinuti in mediu DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) supplementatu cù 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) è 1% penicillina-streptomicina (Thermo Fisher Scientific) à 37 ° C, 5% CO2.incubatrice.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosforu S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosforu S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulina, CST (2128);IgG normale di u mouse, CST (5415S);IgG normale di cunigliu, CST (2729S).L'anticorpi sò stati diluiti 1: 1000 in PBST per Western blotting è 1: 100 per IP.
I sgRNAs sò stati sviluppati utilizendu un strumentu publicamente dispunibule chjamatu CRISPR-ERA66.Avemu utilizatu i paràmetri di l'uttellu predeterminatu per u sviluppu di sgRNA è l'algoritmu hà calculatu i siti di legame sgRNA in a regione 3 kb.centratu à TSS.Pools di oligonucleotidi sgRNA sò stati sintetizzati in CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) è clonati in plasmidi pgRNA umanizzati (Addgene #44248).Un totale di 12 µg di plasmide pgRNA umanizzato aggregato, 7,2 µg di psPAX2 (Addgene # 12260) e 4,8 µg di pMD2.G (Addgene # 12259) sono stati co-trasfettati in 5 x 106 HEK293T in reagenti di trasfezioni di DNA da 10 cm. cellule (CWBIO, Pechino, Cina) seguendo le istruzioni del produttore.I supernatanti chì cuntenenu virus sò stati raccolti 48 è 72 ore dopu a trasfezzione è filtrati attraversu un filtru di 0,45 µm.Per u screening, e cellule SW620 chì esprimenu a proteina di fusione dCas9 / KRAB sò state ottenute da trasduzione di virus.E cellule SW620 modificate sò stati infettati cù a biblioteca di virus in quattru esperimenti di infezzione indipendenti à un MOI di 0,1-0,3 è sò stati campionati cù 2 μg / ml puromicina (Sigma, St. Louis, MO) per 2 ghjorni.Dopu, e cellule sò state cultivate per 18 ghjorni in vitro cù una cobertura minima di biblioteca di 500 cellule / sgRNA per u screening.
L'ADN genomicu hè stata estratta secondu l'istruzzioni di u QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Germany; 51183).In totale, 100 μg di DNA genomicu per ripetizione biologica hè stata utilizata per custruisce a biblioteca.A regione sgRNA hè stata amplificata da duie volte di PCR è ligata à un codice à barre.
I prudutti PCR sò stati purificati cù u gel NucleoSpin® è u kit di purificazione PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germania; 740609.250) è quantificati cù u kit di rilevazione di DNA a doppia fila Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
L'assay MTS hè stata utilizata per misurà a proliferazione cellulare.E cellule sò state seminate in piastre di 96 pozzi à una densità iniziale di 2000 cellule / pozzu.U nùmeru relative di cellule hè stata misurata ogni ghjornu à u tempu indicatu per un totale di 4-6 ghjorni.Per ogni pozzu, 20 μl di reagent MTS (Promega) sò stati diluiti cù 100 μl di DMEM, incubati cù cellule per 4 h à 37 ° C, è dopu OD490 hè stata misurata.
A capacità di crescita unanchored hè stata scuperta analizendu a furmazione di sfere.In breve, 2000 cellule trasfettate cù shRNA DARS-AS1 o shRNA di cuntrollu sò state cultivate in microplates ultra low attachment (Corning) cù un cambiamentu mediu ogni 4 ghjorni.I sferoidi sò stati cuntati dopu à 14 ghjorni.500 cellule trasfettate cù u plasmide di sovraespressione DARS-AS1 o un plasmid di cuntrollu sò stati utilizati per l'assay di rinfurzà, altrimenti u metudu ùn era micca cambiatu.
L'RNA hè stata trascritta cù T7 RNA polimerasi è biotin-16-UTP (Roche 1138908910) secondu l'istruzzioni di Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).I primers usati quì sò listati in a Tabella Supplementaria 4.
E regioni PACT o PKR chì codificanu a proteina sò state clonate in pET15b (Addgene #73619) è trasfurmate in BL21 (DE3).I battìri sò stati incubati durante a notte in LB furnitu cù ampicillin è poi diluted 100-fold cù LB frescu.Quandu l'OD600 di u mediu hà righjuntu 0.8, 1 mM IPTG hè statu aghjuntu per induce l'espressione di a proteina.Dopu l'incubazione durante a notte cù una agitazione suave (250 rpm à 20 ° C), u pellet di cellula hè stata cullata per centrifugazione (4000 rpm, 10 min, 4 ° C).Risospendere il pellet cellulare in tampone di lisi (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) e incubare su ghiaccio per 30 min, poi sonicare (15 min, 5 s on/off, su ghiaccio) e centrifugare (13.000). rpm)., 30 min, 4°С).U surnatante hè stata poi caricata nantu à a resina Ni-NTA (QIAGEN) 3 volte à 4 ° C, lavata 4 volte cù un tampone di lavaggio (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) è eluita 3 volte, cun un totale. di 10 ml di tampone eluente (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).A proteina purificata hè stata determinata cù WB è a cuncentrazione hè stata determinata cù u kit di analisi di proteina Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
L'analisi RIP sò state realizate cum'è descritte prima, cù mudificazioni.In breve, 1x tampone RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasin ribonucleasi inibitore (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteasi) lisi cocktail citostatici 1 x 107 (Roche, 1 mM DTT) e centrifugare a 13.000 rpm per 15 minuti a 4 °C.U supernatant hè statu incubatu cù a proteina A + G perle magnetiche (Millipore) cunjugate cù 5 μg di anticorpu anti-PACT (Abeam) o IgG (CST).I perle sò stati lavati 5 volte cù 5x RIP buffer, poi digeriti cù proteinase K (NEB).L'RNA hè stata estratta cù Trizol è determinata da RT-qPCR.I primi sò presentati in a Tabella Supplementaria 5.
L'analisi RIP in vitro hè stata realizata secondu un protocolu di analisi RIP standard mudificatu.Un totale di 5 pmol di RNA trascritto in vitro hè stata diluita 1x cù tampone RIP è annealed da incubazione à 65 ° C per 5 minuti seguita da un lento raffreddamentu à a temperatura ambiente.Un totale di 5 pmol di proteini PACT marcati cù bandiera intacta o mutata sò purificati da E. coli.Incubate cù RNA rinaturatu per 2 ore à 4 ° C è seguite a prucedura sopra per l'analisi RIP per l'IP anti-bandiera.
Per l'analisi di l'estensione di RNA, 1 × 107 cellule sò state lisate cù buffer 1xRIP.Dopu a centrifugazione à 13.000 rpm per 15 min à 4 ° C, u supernatant hè statu pretrattatu cù 30 μl di perle magnetiche di streptavidina (Beckman) per 2 h à 4 ° C.U lysate purificatu hè statu dopu furnitu cù tRNA di levadura è incubatu cù 40 pmol di RNA rinaturatu durante a notte à 4 ° C, dopu per altre 2 ore è aghjunghjenu 20 μl di novi perle magnetiche di streptavidina bluccate cù BSA.U passu di lavatu hè custituitu da 4 volte cù 5x RIP buffer è 4 volte cù 1x RIP buffer.Le proteine ​​corrispondenti sono state eluite con tampone di eluzione di biotina (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotina, PMSF) e separate su NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Dopu a tintura d'argentu (Beyotime Biotechnology), certi bandi sò stati escisi è analizati da MS.
L'analisi Co-IP hè stata realizata per pruvà l'interazzione trà PACT è PKR.In breve, i lisati supernatanti sò stati preparati incubando 1 x 107 cellule lisate in 1 x tampone RIP seguita da centrifugazione à 13.000 rpm per 15 minuti à 4 ° C.I lisati sò stati caricati cù perle magnetiche di proteina A + G, cunjugati cù 5 µg d'anticorpu anti-PACT, è girati delicatamente durante a notte à 4 ° C.I perle sò stati lavati 3 volte cù 5×RIP buffer, duie volte cù 1×RIP buffer è eluted with 1×SDS buffer.A proteina recuperata hè stata analizata da u gel SDS-PAGE è rilevata da WB.
Dui pmol di PACT marcatu è 1 pmol di PKR sò purificati da E. coli.Diluite in 1 × buffer RIP è incubate cù 10 pmol di RNA rinaturatu per 2 ore à 4 ° C.Dopu à quessa, sò stati incubati cù l'anticorpu anti-etichettatu cunjugatu à perle magnetiche di proteina A + G per duie ore supplementari.I perle sò stati poi lavati quattru volte cù 1x RIP buffer è eluted with 1x SDS buffer.U PACT è PKR risultanti sò stati rilevati da WB.