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I metudi di etichettatura di prossimità enzimatica basati in esteri attivati ​​o radicali fenossi sò largamente usati per cartografia proteomi subcellulari è interattori di proteine ​​​​in cellule viventi.In ogni casu, l'esteri attivati ​​sò menu reattivi, risultatu in un largu raghju di etichettatura, è i radicali fenossi generati da u trattamentu di perossu pò interferiscenu cù e camini redox.Quì riportemu un metudu di fotoattivazione dipendente da l'etichettatura di prossimità (PDPL) sviluppatu liendu geneticamente a proteina fotosensibilizzante miniSOG à una proteina d'interessu.Triggeratu da a luce blu è cuntrullatu da u tempu di esposizione, l'ossigenu singlet hè generatu è dopu l'etichettatura spatiotemporally risolta di i residui di histidine da a sonda anilina hè ottenuta.Avemu dimustratu a so alta fideltà à traversu a mappa di proteome specificu di l'organu.Un paragone side-by-side di PDPL cù TurboID mostra una cobertura proteomica più specifica è cumpleta di PDPL.In seguitu, avemu applicatu PDPL à u coactivatore trascrizionale BRD4 è E3 Parkin ligase associatu à a malatia è truvamu interattori prima scunnisciuti.Per screening di sovraespressione, dui sustrati scunnisciuti, Ssu72 è SNW1, sò stati identificati per Parkin, chì a degradazione hè mediata da a via di ubiquitination-proteasome.
A carattarizazione precisa di e rete di proteine ​​​​suttana parechji prucessi cellulari fundamentali.Dunque, una mappatura spazio-temporale altamente precisa di l'interazzione di e proteine ​​​​furnirà una basa moleculare per decifrare i percorsi biologichi, a patologia di e malatie, è disturbà queste interazzione per scopi terapeutici.Per questu scopu, i metudi capaci di detectà interazzione tempurale in cellule viventi o tessuti sò assai desiderate.A spettrometria di massa di purificazione di affinità (AP-MS) hè stata storicamente usata per identificà i partenarii di legame di proteine ​​​​di interessu (POI).Cù u sviluppu di i metudi di proteomica quantitativa, hè statu creatu Bioplex3.0, a più grande basa di dati di rete di proteine ​​​​basata in AP-MS.Ancu se l'AP-MS hè assai putente, i passi di lisi cellulare è di diluzione in u flussu di travagliu sò preghjudiziati versu interazzioni di ligame debuli è transitori è introducenu artefatti post-lisi cum'è coppie d'interazioni spurie chì mancanu di compartimentazione prima di lisi.
Per affruntà questi prublemi, sò stati sviluppati aminoacidi innaturali (UAA) cù gruppi di reticulazione è piattaforme di etichettatura enzimatica vicina (PL) (per esempiu APEX è BioID)5.Ancu se u metudu UAA hè statu appiicatu cù successu in parechji scenarii è furnisce infurmazioni nantu à l'adesivi diretti di a proteina, l'ottimisazione di u situ di inserimentu UAA hè sempre necessariu.A più impurtante, hè un metudu di etichettatura stechiometrica chì ùn manca una reversione catalitica di l'eventi di etichettatura.In cuntrastu, i metudi PL enzimatici, cum'è u metudu BioID, fusione a biotina ligase ingegneria à POI7, chì successivamente attiva a biotina per furmà un intermediu estere biotinyl-AMP reattivu.L'enzima cataliza è libera una "nuvola" di biotina attivata chì marca i residui di lisina prossimali.Tuttavia, BioID richiede più di 12 ore per ottene un signalu etichettatu suffirenziu, chì impedisce u so usu cù una risoluzione temporale.Utilizendu l'evoluzione diretta basata nantu à a visualizazione di levitu, TurboID hè statu cuncepitu basatu annantu à BioID per esse più efficaci, chì permette un etichettatura efficiente cù biotina in 10 minuti, chì permette di studià prucessi più dinamichi.Perchè TurboID hè assai attivu è i livelli di biotina endogena sò abbastanza per l'etichettatura di livellu bassu, l'etichettatura di fondo diventa un prublema potenziale quandu l'etichettatura altamente rinfurzata è cronometrata hè necessaria da l'aghjunzione di biotina esogena.Inoltre, l'esteri attivati ​​sò pocu reattivi (t1 / 2 ~ 5 min), chì ponu purtà à un grande raghju di etichettatura, soprattuttu dopu a saturazione di i proteini vicini cù biotina 5. In un altru approcciu, a fusione genetica di l'ascorbate peroxidase ingegneria (ie biotin- radicali fenoli è permette l'etichettatura di a proteina in un minutu 9, 10. APEX hè largamente utilizatu per identificà i proteomi subcellulari, i complexi di proteine ​​​​di membrana, è i complexi di proteini di signalazione citosolicu 11, 12. Tuttavia, a necessità di alta concentrazione di perossidi pò affettà e proteine ​​​​o camini redox, disrupting. prucessi cellulari.
Cusì, un novu metudu capace di generà spezie di soppressione di radiu marcatu più reattivu cù una alta precisione spaziale è temporale senza disturbà significativamente i percorsi cellulari serà un aghjuntu impurtante à i metudi esistenti. Parmi les espèces réactives, l'oxygène singulet a suscité l'attention grâce à sa durée de vie courte et son rayon de diffusion limité (t1/2 < 0,6 µs dans les cellules)13. Parmi les espèces réactives, l'oxygène singulet a suscité l'attention grâce à sa durée de vie courte et son rayon de diffusion limité (t1/2 < 0,6 µs dans les cellules)13. Среди Активных НашеАПен Привлекор кемерена Дифтусног (t1радиуст in ílty 0,6+ 0,6 Trà e forme attive, l'ossigenu singlet hà attiratu a nostra attenzione per a so vita curta è u raghju di diffusione limitatu (t1/2 < 0,6 µs in cellule)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs（中1跄滆扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди Активных фомание привлорыи (tжрадиуна О ррадиуна О крадиуса Дифыуса О крадиуи Trà e forme attive, l'ossigenu singlet attrae a nostra attenzione per via di a so vita curta è u raghju di diffusione limitatu (t1 / 2 < 0.6 μs in cellula).L'ossigenu singlet hè statu rapportatu per ossidarà aleatoriamente a metionina, a tirosina, l'histidina è u triptofanu, facendu u polar 14,15 per l'attaccamentu à e sonde basate in amine o tioli16,17.Ancu se l'ossigenu singlet hè statu utilizatu per etichettate l'RNA di u compartimentu subcellulare, e strategie per ripurtà i marcatori di prossimità POI endogeni restanu inesplorati.Quì, prisentamu una piattaforma chjamata etichettatura di prossimità dipendente da fotoattivazione (PDPL), induve usemu a luce blu per illuminà POI fusi cù un fotosensibilizzatore miniSOG è attivanu a generazione di l'ossigenu singlet per ossidà i residui prossimali, seguitu da mudificazioni chì cuntenenu amine per ossidà e sonde chimiche. cellule viventi intermediari..Avemu pruvatu un gruppu di sonde chimiche per maximizà a specificità di l'etichetta è identificanu siti di mudificazione utilizendu un flussu di travagliu di proteomica aperta.Un paragone side-by-side di PDPL cù TurboID mostra una cobertura proteomica più specifica è cumpleta di PDPL.Avemu applicatu stu approcciu à i marcatori specifichi di l'organu di u proteoma subcellulare è l'identificazione generale di proteoma di i partenarii di ubligatoriu per a proteina reguladora epigenetica associata à u cancro BRD4 è a E3 ligase Parkin associata à a malatia di Parkinson, chì hà cunfirmatu una reta di proteina cunnisciuta è scunnisciuta. interazzione..L'abilità di PDPL per ricunnosce i sustrati E3 in grandi cumplessi di proteini rapprisenta una situazione induve u ricunniscenza di i leganti indiretti hè necessariu.Dui substrati parkini scunnisciuti mediati da ubiquitination-proteasome sò stati cunfirmati in situ.
A terapia fotodinamica (PDT) 19 è l'inattivazione laser assistita da cromofori (CALI) 20, in quale l'irradiazione di luce cù fotosensibilizzanti genera ossigenu singlet, pò inattivà e proteine ​​​​di destinazione o causanu a morte cellulare.Siccomu l'ossigenu singlet hè una sustanza altamente reattiva cù una distanza di diffusione teorica di circa 70 nm, l'ossidazione spaziale limitata intornu à u fotosensibilisatore pò esse cuntrullata.Basatu annantu à stu cuncettu, avemu decisu d'utilizà l'ossigenu singlet per ottene l'etichettatura stretta di cumplessi di proteini in e cellule viventi.Avemu sviluppatu un approcciu chemoproteomic PDPL per cumpiendu quattru funzioni: (1) per catalizà a generazione di l'ossigenu singlet attivu simili à l'approcciu enzimaticu PL;(2) furnisce l'etichettatura risolta in u tempu à l'iniziu di a luce;(3) per alterazione (4) Evitate l'usu di cofattori endogeni (cum'è a biotina) per riduce u fondu, o utilizate reagenti esogeni altamente perturbanti (cum'è perossidi) per minimizzà l'esposizione cellulare à u stress ambientale.
I fotosensibilizatori ponu esse divisi in duie categurie, cumpresi i fluorofori di pesu molekulari (per esempiu, rosa bengala, blu di metilene)22 è proteine ​​​​piccole codificate geneticamente (per esempiu miniSOG, KillerRed)23.Per ottene un disignu modulare, avemu sviluppatu a piattaforma PDPL di prima generazione aghjunghjendu proteine ​​​​fotosensibilizzanti (PS) à POI24,25 (Figura 1a).Quandu irradiatu cù luce blu, l'ossigenu singlet oxidizes residui di aminoacidu nucleophilic proximal, risultatu in una polarità umpolung chì hè elettrofila è pò ancu reagisce cù i nucleophiles di sonda amine16,17.A sonda hè cuncepita cù un manicu alquinu per permette di cliccà a chimica è tira per a carattarizazione LC / MS / MS.
Illustrazione schematica di l'etichettatura di cumplessi di proteini mediati da miniSOG.Quandu sò esposti à a luce blu, e cellule chì esprimenu miniSOG-POI generanu l'ossigenu singlet, chì modificanu e proteine ​​​​interagisce, ma micca e proteine ​​​​non-ligate.I prudutti intermedii di a fotoossidazione sò interceptati da etichette relay di a sonda chimica amina per furmà adducts covalenti.U gruppu alchinile nantu à a sonda chimica permette di cliccà a chimica per arricchimentu da pull-down seguita da quantificazione LC-MS/MS.b Struttura chimica di sonde ammina 1-4.c Analisi di gel fluorescente rappresentativa di marcatori proteomici mediati da miniSOG localizati mitocondriali utilizendu sonde 1-4 è quantificazione relativa basata nantu à a densitometria di gel.U rapportu signal-à-sfondu di e sonde chimiche hè statu valutatu utilizendu esperimenti di cuntrollu negativu, escludendu a luce blu o utilizendu cellule HEK293T senza espressione miniSOG.n = 2 campioni biologicamente indipendenti.Ogni puntu rapprisenta una replica biologica.d Rilevazione rappresentativa è quantificazione di PDPL utilizendu a sonda ottimizzata 3 in presenza o assenza di i cumpunenti PDPL indicati cum'è c.n = 3 campioni biologicamente indipendenti.Ogni puntu rapprisenta una replica biologica.E linee centrali è i baffi rapprisentanu a media è a deviazione standard ±.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Imagini confocale di l'ossigenu singlet cù macchia Si-DMA rossu luntanu.Barre d'échelle : 10 µm.L'imaghjini in gel è l'esperimenti cunfocali sò stati ripetuti indipindentamente almenu duie volte cù risultati simili.
Avemu prima pruvatu l'abilità di i fotosensibilizatori maturi miniSOG26 è KillerRed23, espressi stabilmente in HEK293T, per mediate l'etichettatura di propargylamine di u proteoma cum'è sonda chimica (Figura Supplementaria 1a).L'analisi di fluorescenza di gel hà dimustratu chì l'etichettatura di u proteoma tutale hè stata ottenuta utilizendu miniSOG è irradiazione di luce blu, mentre chì ùn hè micca osservatu un pruduttu di marcatura visibile cù KillerRed.Per migliurà u rapportu signale-à-sfondu, dopu avemu pruvatu un settore di sonde chimiche chì cuntenenu anilina (1 è 3), propilamina (2) o benzilamina (4).Avemu osservatu chì e cellule HEK293T anu avutu un signalu di fondu più altu cumparatu cù nisuna luce blu, possibbilmente per via di u fotosensibilizzante riboflavina endogenu, flavin mononucleotide (FMN) 27 . E sonde chimiche basate in aniline 1 è 3 anu datu una migliore specificità, cù HEK293T chì esprime in modu stabile miniSOG in mitocondria chì mostra un aumentu > 8 volte di u signale per a sonda 3, mentri a sonda 2 utilizata in u metudu di marcatura RNA CAP-seq mostra solu ~ 2.5- fold signal accrescimentu, prubabilmente a causa di differente preferenze reattività trà RNA è proteina (Fig. 1b, c). E sonde chimiche basate in aniline 1 è 3 anu datu una migliore specificità, cù HEK293T chì esprime in modu stabile miniSOG in mitocondria chì mostra un aumentu > 8 volte di u signale per a sonda 3, mentri a sonda 2 utilizata in u metudu di marcatura RNA CAP-seq mostra solu ~ 2.5- fold signal accrescimentu, prubabilmente a causa di differente preferenze reattività trà RNA è proteina (Fig. 1b, c).E sonde chimiche basate in aniline 1 è 3 anu dimustratu una megliu specificità: HEK293T, chì esprime stabilmente miniSOG in mitocondria, mostra più di 8 volte in u signale per a sonda 3, mentre chì a sonda 2, utilizata in u metudu di etichettatura CAP-seq RNA, solu. mostra ~ 2.5-fold signal accrescimentu, prubabilmente per via di e diverse preferenze di reattività trà RNA è proteina (Fig. 1b, c).基于 苯胺 探针 探针 探针 1 和 3 具有 更 好 在 线 粒体 中 稳定 表达 MINISOG, 探针探针 Anisog, 探针 3 信号 用 于 Rna 标记标记 Cap - Seq 的 方法 2 仅 显示 ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于基于 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 在 粒体 中 稳定 Minisog, 探针 Domisog, 探针 Domisog, 探针 3. 信号倍 增加 于 RNA 标记 cap-eq 的 2 的-倍信号增加，可能是由于RNAE sonde chimiche basate in aniline 1 è 3 anu una migliore specificità, HEK293T espressa stabilmente miniSOG in mitocondria, è a sonda 3 hà avutu un aumentu di più di 8 volte in u signale, mentre chì a sonda 2 per u metudu di etichettatura di l'ARN CAP-seq mostrava solu ~ 2.5 volte.in u signale, prubabilmente per via di e diverse preferenze di reazione trà RNA è proteina (Fig. 1b, c).Inoltre, l'isomeri di a sonda 3 è i sondi di hydrazine (sonde 5, 6, 7) sò stati pruvati, cunfirmendu l'ottimisazione di a sonda 3 (Figura supplementaria 1b, c).In listessu modu, l'analisi di fluorescenza in gel hà revelatu altri parametri sperimentali ottimizzati: lunghezza d'onda di irradiazione (460 nm), cuncentrazione di sonda chimica (1 mM) è tempu di irradiazione (20 min) (Figura supplementaria 2a-c).L'omissione di qualsiasi cumpunenti o passu in u protokollu PDPL hà risultatu in una reversione significativa di signale à u fondu (Fig. 1d).In particulare, l'etichettatura di a proteina hè stata ridutta significativamente in a presenza di azide di sodiu o trolox, chì sò cunnisciuti per spegne l'ossigenu singlet.A prisenza di D2O, chì hè cunnisciuta per stabilizzà l'ossigenu singlet, aumenta u signale di l'etichettatura.Per investigà a cuntribuzione di l'altri spezii di l'ossigenu reattivu à l'etichettatura, u mannitol è a vitamina C sò stati aghjunti per stabilisce scavengers radicali hydroxyl è superoxide, rispettivamente, 18, 29, ma ùn anu micca truvatu per riduce l'etichettatura.L'aggiunta di H2O2, ma micca l'illuminazione, ùn hà micca risultatu in l'etichettatura (Figura Supplementaria 3a).L'imaghjini di l'ossigenu singlet di fluorescenza cù sonde Si-DMA cunfirmatu a prisenza di l'ossigenu singlet in u filu HEK293T-miniSOG, ma micca in u filu HEK293T originale.Inoltre, mitoSOX Red ùn pudia micca detectà a produzzione di superoxide dopu l'illuminazione (Fig. 1e è Supplementary Fig. 3b) 30. Queste dati suggerenu fermamente chì l'ossigenu singlet hè a spezia principale di l'ossigenu reattivu rispunsevuli di l'etichettatura proteomica sussegwente.A citotossicità di PDPL hè stata valutata cumprese l'irradiazione di luce blu è e sonde chimiche, è ùn hè stata osservata una citotossicità significativa (Figura supplementaria 4a).
Per studià u mecanismu di etichettatura è permette l'identificazione proteomica di cumplessi di proteine ​​​​using LC-MS / MS, avemu prima bisognu di determinà quali aminoacidi sò mudificati è a massa delta di l'etichette di sonda.A metionina, l'histidina, u triptofanu è a tirosina sò stati signalati per esse mudificate da l'ossigenu singlet14,15.Integremu u flussu di travagliu TOP-ABPP31 cù a ricerca aperta imparziale furnita da a piattaforma informatica FragPipe basata in MSFragger32.Dopu a mudificazione di l'ossigenu singlet è l'etichettatura di a sonda chimica, a chimica di clic hè stata realizata utilizendu una etichetta di riduzzione di biotina chì cuntene un linker cleavable, seguita da l'allungamentu di neutravidina è a digestione di tripsina.U peptide mudificatu, sempre ligatu à a resina, hè statu fotoclivatu per l'analisi LC-MS / MS (Figura 2a è Dati Supplementari 1).Un gran numaru di mudificazioni accadutu in tuttu u proteoma cù più di 50 peptide map (PSM) matchs listed (Fig. 2b).Sorprendentemente, avemu osservatu solu a mudificazione di l'histidina, prubabilmente per via di a reattività più alta di l'histidina ossidata versu e sonde di anilina cà l'altri aminoacidi.Sicondu u mekanismu publicatu di l'ossidazione di l'histidina per l'ossigenu singlet,21,33 a struttura di massa delta proposta di + 229 Da currisponde à l'adduzione di a sonda 3 cù 2-oxo-histidine dopu duie oxidazioni, mentri + 247 Da hè u pruduttu di l'idrolisi. di + 229 Da (Figura Supplementaria 5).L'evaluazione di u spettru MS2 hà dimustratu una alta affidabilità di l'identificazione di a maiò parte di i ioni y è b, cumpresa l'identificazione di ioni di frammenti mudificati (y è b) (Fig. 2c).L'analisi di u cuntestu di a sequenza lucale di istidine modificate da PDPL hà revelatu una preferenza moderata di motivi per i picculi residui idrofobici in posizioni ± 1 (Figura supplementare 4b).In media, 1.4 histidines sò stati identificati per a proteina, è i siti di questi marcatori sò stati determinati da a superficia accessibile di solvente (SASA) è l'analisi di a dispunibilità di solvente relative (RSA) (Figura supplementaria 4c, d).
Un flussu di travagliu imparziale per studià a selettività residua utilizendu a piattaforma informatica FragPipe alimentata da MSFragger.I linkers cleavable sò usati in a chimica di Click per permette u photocleavage di peptidi mudificati da a resina di streptavidin.Una ricerca aperta hè stata lanciata per identificà numerosi mudificazioni, è ancu i resti pertinenti.b Assignà a massa di mudificazioni chì sò in tuttu u proteoma.Cartografia di peptidi PSM.c MS2 annotazione spettrale di siti histidine mudificate cù a sonda 3. Cum'è un esempiu rappresentativu, una reazione covalente cù a sonda 3 aghjunghjenu + 229.0938 Da à l'aminoacidu mudificatu.d Test di mutazione utilizatu per pruvà i marcatori PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) è PRDX1 (H10A, H81A, H169A) sò stati trasfettati cù plasmidi salvatichi per a rilevazione anti-Flag.e U peptide sinteticu hè statu reagitu cù miniSOG purificatu in a presenza di a sonda 3 è i prudutti currispondenti cù Δm + 247 è + 229 sò stati nutati in u spettru LC-MS.f Interazzione in vitro di proteina à proteina modellata cù miniSOG-6xHis-tag è anti-6xHis anticorpu.Antibiotina (streptavidin-HRP) è analisi Western blot anti-mouse di complexi di anticorpi miniSOG-6xHis/anti-6xHis marcati cù a sonda 3, secondu u tempu di esposizione à a luce.L'etichette per e proteine ​​​​individuali sò espresse in u pesu moleculare currispundente: catena ligera di anticorpi LC, catena pesante di anticorpi HC.Questi esperimenti sò stati ripetuti indipindentamente almenu duie volte cù risultati simili.
Per a verificazione biochimica di u situ di l'etichettatura, PRDX3 è PRDX1 identificati da spettrometria di massa sò stati cambiati da histidine à alanine è paragunati à u tipu salvaticu in i saggi di trasfezzione.I risultati PDPL dimustranu chì a mutazione hà riduciutu significativamente l'etichettatura (Fig. 2d).Intantu, e sequenze di peptide identificate in a ricerca aperta sò state sintetizzate è reagiscenu in vitro cù miniSOG purificatu in a presenza di a sonda 3 è di a luce blu, cedendu prudutti cù un cambiamentu di massa di + 247 è + 229 Da quandu sò rilevati da LC-MS (Fig. .2e).).Per pruvà se e proteine ​​​​proximali chì interagiscenu puderanu esse etichettate in vitro in risposta à a fotoattivazione miniSOG, avemu cuncepitu un test di prossimità artificiale per interazzione trà a proteina miniSOG-6xHis è un anticorpu monoclonale anti-His in vitro (Figura 2f).In questu analisi, avemu aspittatu l'etichettatura prossimale di catene pesanti è leggere di anticorpi cù miniSOG.In fatti, anti-mouse (ricunnoscendu i catene pisanti è liggeru di l'anticorpu anti-6xHis-labeled) è streptavidin Western blots dimustratu forte biotinylation di i catene pisanti è ligeri.In particulare, avemu nutatu l'autobiotinilazione miniSOG per l'etichetta 6xHis è i ligami incruciati trà catene ligeri è pesanti, chì ponu esse ligati à a distanza descritta prima trà a risposta prossimale di lisina è 2-oxo-histidine.In cunclusioni, cuncludemu chì PDPL modifica l'histidina in modu dipendente da a vicinanza.
U nostru prossimu scopu era di caratterizà u proteoma subcellulare per pruvà a specificità di l'etichettatura in situ.Per quessa, avemu stabilitu spressu miniSOG in u nucleu, a matrice mitocondriale, o a membrana ER esterna di e cellule HEK293T (Fig. 3a).L'analisi di fluoriscenza di u gelu palesanu bandi marcati abbundanti in trè lochi subcellulari è ancu mudelli di etichettatura differenti (Fig. 3b).L'analisi di l'imaghjini di fluorescenza dimustrava una alta specificità di PDPL (Fig. 3c).U flussu di travagliu PDPL hè statu seguitu da reazioni di clicche cù coloranti di rodamina per delineà i proteomi subcellulari utilizendu microscopia di fluorescenza, è i segnali PDPL sò stati colocalizzati cù DAPI, trackers mitocondriali, o trackers ER, cunfirmendu l'alta fideltà di PDPL.Per i trè lochi di l'organu, una comparazione side-by-side di PDPL cù TurboID utilizendu avidin western blot hà dimustratu chì PDPL hè stata marcata più specificamente cumparatu cù i so cuntrolli rispettivi.In e cundizioni PDPL, apparsu più bandi marcati, chì indicanu più proteini marcati PDPL (Figura supplementaria 6a-d).
una Rappresentazione schematica di l'etichettatura di proteome specificu di organelle mediata da miniSOG.miniSOG mira à a matrice mitocondriale via fusione à i 23 aminoacidi N-terminali di COX4 umanu (mito-miniSOG), u nucleu via fusione à H2B (nucleus-miniSOG), è Sec61β via u latu citoplasmaticu di a membrana ER (ER-miniSOG). ).L'indicazioni includenu l'imaghjini in gel, l'imaghjini confocali è a spettrometria di massa.b Imàghjini rapprisintanti di gel di trè profili PDPL specifichi di organelli.CBB Coomassie Blu Brillante.c Immagini confocali rappresentative di cellule HEK293T che esprimono stabilmente miniSOG con diverse localizzazioni subcellulari rilevate da anticorpi marcati V5 (rosso).I marcatori subcellulari sò usati per a mitocondria è ER (verde).U flussu di travagliu PDPL include a rilevazione di proteomi subcellulari marcati miniSOG (giallo) utilizendu a chimica di clic Cy3-azide.Barre d'échelle : 10 µm.d Trame vulcaniche di proteomi marcati da PDPL in vari organelli quantificati da quantificazione senza etichetta (n = 3 esperimenti biologichi indipendenti).T-test di Studenti à dui coda hè stata aduprata nantu à i terreni di u vulcanu.HEK293T tipu salvaticu hè statu usatu comu un cuntrollu negativu. I proteini significativamente cambiati sò evidenziati in rossu (p <0.05 è > 2-fold differenza di intensità di ioni). I proteini significativamente cambiati sò evidenziati in rossu (p <0.05 è > 2-fold differenza di intensità di ioni). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интеснов). E proteine ​​​​alterate significativamente sò evidenziate in rossu (p <0.05 è > 2-fold differenza in intensità di ioni).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионлей). I proteini alterati significativamente sò evidenziati in rossu (p <0.05 è> 2-fold differenza in forza ionica).I proteini rilativi impurtanti per HEK293T-miniSOG ma micca impurtanti per HEK293T sò mostrati in verde.e Analisi di a specificità di i datasets proteomica da esperimenti d.U numeru tutale di proteini statisticamente significati in ogni organellu (punti rossi è verdi) hè marcatu in cima.Histograms mostranu proteini localizzati in organelli basatu nantu à MitoCarta 3.0, analisi GO è A. Ting et al.ghjente.Datasets separati per mitocondria, nuclei è ER.Questi esperimenti sò stati ripetuti indipindentamente almenu duie volte cù risultati simili.I dati crudi sò furniti in forma di schedarii di dati crudi.
Incoraggiatu da i risultati di u gel è di l'imaghjini, a quantificazione senza etichetta hè stata aduprata per quantificà u proteoma identificatu in ogni organellu (Dati Supplementari 2).Untransfected HEK293T hè stata utilizata cum'è un cuntrollu negativu per sottrae i marcatori di fondo. L'analisi di a trama di u vulcanu hà mostratu proteini significativamente arricchiti (p < 0,05 è> intensità di ioni di 2 volte) è ancu e proteini singleton chì sò solu prisenti in miniSOG-espressione linee (Fig. 3d punti rossi è verdi). L'analisi di a trama di u vulcanu hà mostratu proteini significativamente arricchiti (p < 0,05 è> intensità di ioni di 2 volte) è ancu e proteini singleton chì sò solu prisenti in miniSOG-espressione linee (Fig. 3d punti rossi è verdi). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). L'analisi di a trama di u vulcanu dimustrava proteini significativamente arricchiti (p <0.05 è> intensità di ioni di 2 volte) è ancu di proteine ​​​​single chì sò prisenti solu in e linee miniSOG-espressione (Fig. 3d, punti rossi è verdi).A火山 Alloghju 显着 富集 富集 显着 富集 的 蛋白质 (p <005 和> 2 仅倍 存) 以及以及 仅仅 MICISAG 表达 系 中 的 单 一蛋白质 图和Y).火山 Allogu 出 显着 显着 的 蛋白质 (p <005 和> 2 存倍 强度表达) 仅仅 minisog 在 系绿色 一蛋白质 系绿色 红色 绿色 系'swood 绿色绿色 Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). L'analisi di a trama di u vulcanu palesanu proteini significativamente arricchiti (p <0.05 è> 2x forza ionica) è ancu e proteine ​​singuli prisenti solu in a linea d'espressione miniSOG (punti rossi è verdi in Fig. 3d).Cumminendu sti dati, avemu identificatu 1364, 461 è 911 proteini nucleari, mitocondriali è ER di a membrana esterna statisticamente significati, rispettivamente.Per analizà l'accuratezza di PDPL localizzati in organelle, avemu usatu MitoCarta 3.0, Analisi di Gene Ontology (GO), è A. Ting et al.un set di dati 8 hè stata utilizata per a mitocondria, u nucleu è l'ER per pruvà a specificità di l'organu di i proteini detecati, chì currisponde à una precisione di 73,4, 78,5 è 73,0% (Fig. 3e).A specificità di PDPL cunfirma chì PDPL hè un strumentu ideale per identificà i proteomi specifichi d'organelle.In particulare, l'analisi submitocondriale di e proteine ​​​​mitocondriali identificate hà dimustratu chì u proteoma intrappulatu era principalmente distribuitu in a matrice è a membrana interna (226 è 106, rispettivamente), cuntendu u 91,7% (362) di u numeru tutale di proteine ​​​​mitocondriali identificate.un altu livellu di PDPL hè ancu cunfirmatu (Figura supplementaria 7a).In listessu modu, l'analisi subnucleare hà dimustratu chì u proteoma catturatu era principalmente distribuitu in u nucleu, u nucleoplasma è u nucleolu (Figura supplementaria 7b).L'analisi proteomica nucleare cù un peptide di signale di localizazione nucleare (3xNLS) hà dimustratu una precisione simile à a custruzzione H2B (Figura supplementaria 7c-h).Per determinà a specificità di u marcatu PDPL, a laminina nucleare A hè stata scelta cum'è una trappula POI7 più discretamente localizzata.PDPL hà identificatu 36 proteini significativamente arricchiti, di quali 12 proteini (30.0% cumpresa lamin A) eranu proteini interattivi di lamin A ben carattarizatu annotati da a basa di dati String, cù un percentinu più altu ch'è u metudu BioID (proteini 122) 28 di 28. , 22.9 %) 7. U nostru metudu hà identificatu menu proteini, possibbilmente per via di spazii di etichettatura limitati, chì era pussibule da l'ossigenu singlet più attivu.L'analisi GO hà dimustratu chì e proteine ​​​​identificate eranu principalmente situate in u nucleoplasma (26), a membrana nucleare (10), a membrana nucleare (9) è i pori nucleari (5).In modu cullettivu, sti proteini nucleari-localizzati cuntavanu 80% di e proteine ​​​​arricchite, dimustrendu ancu a specificità di PDPL (Figura supplementaria 8a-d).
Dopu avè stabilitu a capacità di PDPL per realizà a marcatura di prossimità in organelli, avemu poi pruvatu se PDPL puderia esse usatu per analizà i partenarii di ubligatoriu POI.In particulare, avemu cercatu di definisce l'analisi PDPL di i proteini citosolichi, chì sò cunsiderati obiettivi più difficiuli cà i so contraparti localizzati in a membrana per via di a so natura altamente dinamica.A proteina bromodomain è extraterminal (BET) BRD4 hà attiratu a nostra attenzione per u so rolu chjave in diverse malatie 35, 36.U cumplessu furmatu da BRD4 hè un coattivatore trascrizionale è un scopu terapeuticu impurtante.Per regula l'espressione di i fatturi di trascrizzione c-myc è Wnt5a, BRD4 hè pensatu per esse un determinante chjave di leucemia mieloide aguda (AML), mieloma multiplo, linfoma di Burkitt, cancro di u colon è malatie inflammatorii37,38.Inoltre, certi virus miranu à BRD4 per regulà a trascrizione virale è cellulare, cum'è papillomavirus, HIV è SARS-CoV-236,39.
Per cartografia l'interazzione BRD4 cù PDPL, avemu cumminatu miniSOG cù una corta isoforma N- o C-terminale di BRD4.I risultati proteomici anu revelatu un altu gradu di sovrapposizione trà e duie custruzzioni (Figura Supplementaria 9a).U proteoma nucleare identificatu cù miniSOG-H2B copre 77.6% di e proteine ​​​​interagisce cù BRD4 (Figura Supplementaria 9b).Allora, diversi tempi di illuminazione (2, 5, 10, 20 min) sò stati utilizati per aghjustà u raghju di u marcatore (Fig. 4a è dati supplementari 3).Cuncludemu chì à i fotoperiodi più brevi, PDPL etichettarà principalmente i partenarii di legame direttu, mentre chì i periodi più longu includeranu proteine ​​​​identificate durante periodi di fotoattivazione più brevi, è ancu obiettivi indiretti in complexi di etichettatura.In fatti, avemu trovu una forte sovrapposizione trà i punti di tempu adiacenti (84.6% per 2 è 5 min; 87.7% per 5 è 10 min; 98.7% per 10 è 20 min) (Fig. 4b è Supplementary Fig. 9c).In tutti i gruppi sperimentali, truvamu micca solu l'auto-etichettatura BRD4, ma parechji miri cunnisciuti cum'è MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A è HMGB1 annotati in a basa di dati di stringa.A forza ionica di questi miri hè proporzionale à u tempu d'esposizione (Fig. 4c è Supplementary Fig. 9d).L'analisi GO di e proteine ​​​​identificate in u gruppu di 2 minuti hà dimustratu chì e proteine ​​​​identificate eranu localizzate in u nucleu è eranu implicati in a rimodellazione di cromatina è a funzione di RNA polimerasi.A funzione molekulari di a proteina hè stata arricchita in a cromatina di ubligatoriu o a coactivation transcriptional, coherente cù a funzione BRD4 (Fig. 4d).L'analisi di l'interazzione di a proteina attivata da a basa di stringa hà revelatu un primu livellu d'interazzione indiretta trà BRD4 è HDAC cum'è SIN3A, NCOR2, BCOR, è SAP130 (Fig. 4e è Supplementary Fig. 9e), coherente cù BRD4 è HDAC chì liganu istoni acetilati. ..Inoltre, i miri rappresentativi identificati da LC-MS / MS, cumpresi Sin3A, NSUN2, Fus è SFPQ, sò stati cunfirmati da Western blotting (Fig. 4f).Ricertamenti, l'isoforma corta di BRD4 hè stata rappurtata per furmà nuclei cù proprietà di separazione di fase liquid-liquid (LLPS).E proteine ​​​​di legame RNA Fus è SFPQ medianu i LLPS di diversi prucessi cellulari è sò state identificate quì cum'è proteine ​​​​di legame BRD4 non registrate.L'interazzione trà BRD4 è SFPQ hè stata cunfirmata da esperimenti di co-immunoprecipitation (co-IP) (Figura 4g), suggerendu un altru mecanismu per a separazione di fase liquidu-liquidu mediata da BRD4 chì merita più investigazioni.Inseme, questi risultati suggerenu chì PDPL hè una piattaforma ideale per identificà BRD4 cunnisciuti chì interagiscenu cum'è proteine ​​​​di legame scunnisciute.
a Rappresentazione schematica di a marcatura di prossimità BRD4 mediata da miniSOG, tempi di esposizione: 2, 5, 10 è 20 min.b Sovrapposizione di proteine ​​​​identificate in diversi tempi di illuminazione.L'arricchimentu di proteine ​​​​identificatu in HEK293T-miniSOG-BRD4 era statisticamente significativu cumparatu cù HEK293T di tipu salvaticu.c Intensità di ioni quannu quantifying rapprisentanti senza etichetta cunnisciuti prutiìni BRD4-binding durante u tempu di esposizione specificatu.n = 3 campioni biologicamente indipendenti.I dati sò presentati cum'è media ± deviazione standard.d Analisi ontologica di Gene (GO) di e proteine ​​​​identificate in u gruppu di 2 minuti.I primi deci termini GO sò listati.E bolle sò culurite secondu a categuria di termu GO, è a dimensione di a bolla hè proporzionale à u numeru di proteini truvati in ogni termu.e Analisi di stringhe di proteine ​​​​interagisce cù BRD4.I circles gialli sò cola diretta è i circles grisgi sò a prima capa di cola indiretta.I linii rossi rapprisentanu l'interazzione determinate sperimentalmente è e linee blu rapprisentanu l'interazzione prediche.f Obiettivi di ubligatoriu BRD4 rappresentanti identificati in LC-MS / MS sò stati verificati da Western blotting.g Esperimenti di Co-immunoprecipitation cunfirmanu l'interazzione trà SFPQ è BRD4.Questi esperimenti sò stati ripetuti indipindentamente almenu duie volte cù risultati simili.I dati crudi sò furniti in forma di schedarii di dati crudi.
In più di l'identificazione di targets associati à POI micca registrati, ipotisemu chì PDPL serà adattatu per identificà i sustrati per l'enzimi, chì avaristi bisognu di a carattarizazione di e proteine ​​​​di legame indiretti in grandi cumplessi per annotà sustrati micca registrati.Parkin (codificata da PARK2) hè una ligasi E3 è mutazioni in parkin sò cunnisciute per causà a malatia di Parkinson juvenile autosomale recessiva (AR-JP)42.Inoltre, u parkin hè statu scrittu cum'è essenziale per a mitofagia (autofagia mitocondriale) è a rimozione di spezie di l'ossigenu reattivu.In ogni casu, ancu s'è parechji sustrati di parkini sò stati identificati, u rolu di parkin in questa malatia resta micca chjaru.Per annotà i so sustrati micca caratterizati, PDPL hè statu pruvatu aghjunghjendu miniSOG à u N- o C-terminus di parkin.E cellule sò state trattate cù u trasportatore di protoni di cianuro di carbonile m-chlorophenylhydrazone (CCCP) per attivà a parkin via a via PINK1-Parkin.Paragunatu à i nostri risultati BRD4 PDPL, a fusione di parkin N-terminale hà revelatu un inseme più grande di proteine ​​​​di destinazione, anche se copre una parte più grande di u C-terminus (177 fora di 210) (Figura 5a, b è Dati Supplementari 4).u risultatu hè coherente cù i rapporti chì i tag N-terminali ponu attivà aberrante Parkin44.Sorprendentemente, ci era solu 18 proteini sovrapposte in i nostri dati cù risultati AP-MS publicati per Parkin43, prubabilmente per via di differenze trà e linee cellulari è i flussi di travagliu di proteomica.In più di quattru proteini cunnisciuti (ARDM1, HSPA8, PSMD14 è PSMC3) identificate da dui metudi (Fig. 5c) 43.Per cunvalidà ulteriormente i risultati di LC-MS / MS, u trattamentu PDPL è i successivi Western blotting sò stati utilizati per paragunà i risultati di l'analisi di e cellule parentali HEK293T è a linea di parkin N-terminale stabile.Previously unknown targets CDK2, DUT, CTBP1, è PSMC4 sò stati pruvati cù un binder cunnisciutu, DNAJB1 (Fig. 5d).
Trama di vulcanu di proteine ​​​​interagisce cù parkin in cellule HEK293T cù miniSOG espressi stabilmente fusi à u N- o C-terminale di parkin (n = 3 esperimenti biologichi indipendenti).T-test di Studenti à dui coda hè stata aduprata nantu à i terreni di u vulcanu.HEK293T hè stata utilizata com un cuntrollu negativu. I proteini significativamente cambiati sò evidenziati in rossu (p <0.05 è > 2-fold differenza di intensità di ioni). I proteini significativamente cambiati sò evidenziati in rossu (p <0.05 è > 2-fold differenza di intensità di ioni). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интеснов). E proteine ​​​​alterate significativamente sò evidenziate in rossu (p <0.05 è > 2-fold differenza in intensità di ioni).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионлей). I proteini alterati significativamente sò evidenziati in rossu (p <0.05 è> 2-fold differenza in forza ionica).I proteini rilativi impurtanti per HEK293T-miniSOG ma micca impurtanti per HEK293T sò mostrati in verde.b Diagramma di Venn chì mostra e proteini sovrapposte trà e custruzzioni N-terminali è C-terminali.I tag N-terminali ponu attivà aberrantemente a parkin è risultatu in proteine ​​​​più ricunnisciute.c Diagramma di Venn chì mostra e proteini sovrapposte trà PDPL è AP-MS.L'interattori cunnisciuti sò elencati, cumprese 4 di 18 proteini sovrapposte è 11 di 159 proteine ​​​​specificamente identificate in PDPL.d Obiettivi rappresentativi identificati da LC-MS / MS sò stati verificati da Western blotting.e Ssu72 è SNW1 sò stati identificati cum'è sustrati parkini micca registrati.Questi plasmidi di proteina marcati FLAG sò stati trasfettati in HEK293T è HEK293T-Parkin-miniSOG seguitu da trattamentu CCCP in parechji punti di tempu.A degradazione era più pronunciata in a linea di overexpression Parkin.f Utilizendu l'inhibitore di proteasoma MG132, hè statu cunfirmatu chì u prucessu di degradazione di Ssu72 è SNW1 hè mediatu da ubiquitinazione di u proteasoma.Questi esperimenti sò stati ripetuti indipindentamente almenu duie volte cù risultati simili.I dati crudi sò furniti in forma di schedarii di dati crudi.
In particulare, e proteine ​​​​identificate da PDPL devenu include proteine ​​​​di parkin-binding è i so sustrati.Per detectà i sustrati di parkini non registrati, avemu sceltu sette proteine ​​​​identificate (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 è SNW1) è plasmidi trasfettati per espose questi geni à HEK293T normale è esprimenu stabilmente HEK293T di miniSOG-Parkin seguita da u trattamentu CCCP.I livelli di i proteini Ssu72 è SNW1 sò stati significativamente ridotti in a linea stabile miniSOG-Parkin (Fig. 5e).U trattamentu cù CCCP per 12 ore hà risultatu in a degradazione più significativa di i dui sustrati.Per investigà s'ellu a degradazione di Ssu72 è SNW1 hè regulata da ubiquitination-proteasome, l'inhibitore di proteasoma MG132 hè stata aghjunta per inibisce l'attività di proteasoma, è in fatti avemu trovu chì u so prucessu di degradazione hè stata impedita (Fig. 5f).Obiettivi supplementari senza substratu sò stati cunfirmati cum'è interattori Parkin cù Western blotting (Figura Supplementaria 10), chì dimustrava risultati coerenti cù LC-MS / MS.In cunclusione, l'integrazione di u flussu di travagliu PDPL cù a verificazione di trasfezzione di a proteina di destinazione permette l'identificazione di sustrati E3 ligase non registrati.
Avemu sviluppatu una piattaforma di marcatura di prossimità cumuna chì vi permette di identificà in u spaziu è u tempu POI chì interagiscenu.A piattaforma hè basata nantu à a proteina miniSOG photosensitizer, chì hè solu circa 12 kDa, menu di a mità di a dimensione di l'enzima APEX2 matura (27 kDa) è un terzu di a dimensione di TurboID (35 kDa).A dimensione più chjuca duveria espansione assai a gamma di applicazioni per studià i picculi interatomi di proteine.Un'ulteriore esplorazione di fotosensibilizatori supplementari, sia proteine ​​​​codificate geneticamente o molécule chjuche, hè necessaria per aumentà u rendimentu quantum di l'ossigenu singlet è espansione a sensibilità di stu approcciu.Per a versione attuale di miniSOG, una alta risoluzione temporale pò esse ottenuta usendu l'illuminazione blu per attivà i marcatori di prossimità.Inoltre, u tempu di esposizione più longu hà liberatu una "nuvola" più grande di l'ossigenu singlet, risultatu in una mudificazione di residui di histidine più distali, un raghju di etichettatura aumentatu, è a capacità di sintonizà a risoluzione spaziale PDPL.Avemu ancu pruvatu sette sonde chimiche per aumentà u rapportu signal-à-sfondu è esploratu u mecanismu moleculare daretu à stu approcciu.U flussu di travagliu TOP-ABPP cumminatu cù una ricerca aperta imparziale hà cunfirmatu chì e mudificazioni sò accadute solu in l'histidine è ùn hè micca osservatu un microambientu coherente per l'incrementu di l'histidine, eccettu per una preferenza moderata per l'histidine in a regione di u ciclu.
U PDPL hè statu ancu utilizatu per caratterizà i proteomi subcellulari cù specificità di proteoma è una copertura almenu paragunabili à altre etichettatura di prossimità è metudi di sonda chimica specifichi per l'organu.I marcatori di prossimità sò stati ancu utilizati cù successu per caratterizà a superficia, i lisosomi è i proteomi associati à i secretomi46,47.Cridemu chì PDPL serà cumpatibile cù questi organelli subcellulari.Inoltre, avemu sfidatu PDPL identificendu obiettivi per u legame di a proteina citosolica chì sò più cumplessi cà e proteine ​​​​ligate à a membrana per via di e so proprietà dinamiche è di l'implicazione in più interazzioni temporali.PDPL hè stata applicata à duie proteine ​​​​, u coactivator transcriptional BRD4 è a ligase E3 Parkin associata à a malatia.Sti dui proteini sò stati scelti micca solu per e so funzioni biologiche fundamentali, ma ancu per a so rilevanza clinica è u putenziale terapeuticu.Per questi dui POI, sò stati identificati partenarii vincolanti ben cunnisciuti è ancu targets micca registrati.In particulare, a proteina SFPQ assuciata à a separazione di fasi hè stata cunfirmata da co-IP, chì pò indicà un novu mecanismu da quale BRD4 (isoforma corta) regula LLPS.À u listessu tempu, credemu chì l'identificazione di sustrati Parkin hè un scenariu in quale l'identificazione di adesivi indiretti hè necessariu.Avemu identificatu dui sustrati parkini micca identificati è cunfirmatu a so degradazione longu u percorsu di ubiquitination-proteasome.Recentemente, hè stata sviluppata una strategia di trappulu basata in meccanismi per detectà i sustrati di l'idrolasi intrappunduli cù enzimi.Ancu s'ellu hè un metudu assai putente, ùn hè micca adattatu per l'analisi di sustrati implicati in a furmazione di grandi cumplessi è esige a furmazione di ligami covalenti trà l'enzima è u sustrato.Aspittemu chì PDPL pò esse allargatu per studià altri cumplessi di proteine ​​​​è famiglie di enzimi, cum'è e famiglie di deubiquitinase è metalloproteasi.
Una nova forma di miniSOG, chjamata SOPP3, hè stata sviluppata cù a pruduzzione d'ossigenu singlet mejorata.Avemu paragunatu miniSOG cù SOPP3 è truvamu un rendimentu di marcatura mejoratu, ancu s'è u rapportu signal-to-noise resta invariatu (Figura supplementaria 11).Avemu l'ipotesi chì l'ottimisazione di SOPP3 (per esempiu, per mezu di l'evoluzione diretta) porta à proteine ​​​​fotosensibilizzanti più efficaci chì necessitanu tempi di luce più brevi è cusì permettenu di catturà prucessi cellulari più dinamichi.In particulare, a versione attuale di PDPL hè limitata à l'ambiente cellulare, postu chì esige l'illuminazione di luce blu è ùn pò micca penetrà in i tessuti profondi.Sta funziunalità impedisce u so usu in studii di mudelli animali.Tuttavia, a cumminazzioni di optogenetica cù PDPL puderia furnisce una opportunità per a ricerca in animali, in particulare in u cervellu.Inoltre, altri fotosensibilizatori infrared ingegneriati eliminanu ancu sta limitazione.A ricerca hè attualmente in corso in questu settore.
A linea cellulare HEK293T hè stata ottenuta da ATCC (CRL-3216).A linea cellulare hè stata testata negativa per l'infezione da micoplasma è hè stata cultivata in DMEM (Thermo, # C11995500BT) supplementatu cù 10% di siero fetale bovinu (FBS, Vistech, # SE100-B) è 1% penicillina / streptomicina (Hyclone, # SV30010).cresciuta in.
3-Aminophenylene (sample 3) è (4-ethynylphenyl)methanamine (sample 4) sò stati acquistati da Bidepharm.Propylamine (sonda 2) hè stata acquistata da Energy-chemicals.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (sonda 1) hè stata sintetizzata secondu i metudi publicati.
A Tabella Supplementaria 1 elenca i custrutti genetichi utilizati in stu studiu.I sequenze miniSOG è KillerRed sò stati clonati da un plasmid rigalu da P. Zou (Università di Pechino).A sequenza di destinazione di a matrice mitocondriale hè stata derivata da l'aminoacidi 23 N-terminali di COX4 è clonata in i vettori indicati utilizendu una assemblea Gibson (Beyotime, # D7010S).Per destinà a membrana è u nucleu di u reticulum endoplasmaticu, SEC61B DNA umanu (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) amplificatu da PCR da una biblioteca cDNA di cellule HEK293T, è DNA H2B (donatu da D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) è clonatu, cum'è citatu sopra.Salvo indicazione contraria, altri geni di proteine ​​​​usati per a trasfezione è a custruzzione di linee cellulari stabili sò stati amplificati da PCR da a biblioteca di cDNA di e cellule HEK293T.G3S (GGGS) è G4S (GGGGS) sò stati usati cum'è linkers trà a proteina di l'esca è miniSOG.Un tag epitope V5 (GKPIPNPLLGLDST) hè statu aghjuntu à questi custrutti di fusione.Per l'espressione in i mammiferi è per stabilisce una linea cellulare stabile, a custruzzione di fusione miniSOG hè stata subclonata in u vettore lentivirali pLX304.Per l'espressione batterica, miniSOG hè stata clonata in u vettore pET21a marcatu 6xHis à u C-terminale.
E cellule HEK293T sò state seminate à 2.0 x 105 cellule per pozzu in piastre di sei pozzetti è trasfettate 24 ore dopu cù plasmidi lentivirali recombinanti (2.4 μg pLX304) è plasmidi di imballaggio virali (1.5 μg psPAX2 è 1.2 μg pMD2. , #C0533), circa 80% di fusione.Dopu a trasfezzione di notte, u mediu hè cambiatu è incubatu per un'altra 24 ore.A cullizzioni di u virus hè stata fatta dopu à 24, 48 è 72 ore.Prima di l'infezzione di e linee di e cellule di destinazione, u mediu virali hè stata filtrata attraversu un filtru di 0,8 μm (Merck, #millex-GP) è u polybrene (Solarbio, #H8761) hè statu aghjuntu à una cuncentrazione di 8 μg/ml.Dopu à l'ora di 24, i celluli sò stati permessi di ricuperà cambiendu u mediu.E cellule sò state scelte cù 5 μg / ml di blasticidin (Solarbio, # 3513-03-9) per i primi trè passaggi cum'è una selezzione più stretta.Dopu aduprate 20 μg/ml cum'è un regimen più strettu per i trè passaggi successivi.
E cellule sò state seminate in camere di 12 pozzi (Ibidi, #81201) à una densità di circa 20 000 cellule per pozzu.Per migliurà l'adesione di e cellule HEK293T, aghjunghje 50 µg/ml di fibronectina (Corning, #356008) diluita in una soluzione salina tamponata fosfatatu (PBS, Sangon, #B640435) à 37 ° C.I camere sò stati pretrattati per 1 ora è dopu eliminati cù PBS.Dopu à 24 ore, e cellule sò state lavate una volta cù PBS, incubate cù a sonda 3 1 mM in una soluzione salina equilibrata di Hanks fresca (HBSS, Gibco, #14025092) per 1 h à 37 ° C, è poi incubate cù un LED blu (460 nm). ).) sò stati irradiati per 10 min à a temperatura di l'ambienti.Dopu quì, e cellule sò lavate duie volte cù PBS è fissate cù 4% formaldehyde in PBS (Sangon, #E672002) per 15 minuti à a temperatura di l'ambienti.L'eccessu di formaldeide hè stata eliminata da e cellule fissi lavando trè volte cù PBS.E cellule sò state permeabilizate cù 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) in PBS è lavate 3 volte cù PBS.Allora sguassate a camera è aghjunghje à ogni campione 25 µl di una mistura di reazione clic chì cuntene 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) è 0,5 mg / ml di sodium ascorbate (Aladdin, no. S105024) è incubate per 30 minuti à a temperatura di l'ambienti.Dopu una reazione snap, e cellule sò lavate sei volte cù PBS chì cuntene 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) è dopu bluccatu cù 5% BSA (Abcone, #B24726) in PBST per 30 minuti à a temperatura di l'ambienti.
Per l'immunostaining di colocalizazione, e cellule sò state incubate cù anticorpi primari secondu e cundizioni indicate: mouse anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), rabbit anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), Anticorpo policlonale anti-calnexin di cuniglio (1: 500, Abcam, # ab22595) o anticorpo monoclonale anti-lamina A / C di coniglio (1: 500; CST, # 2032) à 4 ° C durante a notte.Dopu avè lavatu 3 volte cù PBST, e cellule sò state incubate cù anticorpi secundari: capra anti-coniglio Alexa Fluor 488 (Thermo, # A11034) diluita 1: 1000, capra anti-mouse Alexa Fluor 594 (CST, # 8889) diluita 1: 1000.dilution Dilute à a temperatura di l'ambienti per 30 minuti.E cellule sò state poi lavate 3 volte cù PBST è cuntrastate cù DAPI (Thermo, # D1306) in PBS per 10 minuti à a temperatura di l'ambienti.Dopu à 3 lavaggi cù PBS, e cellule sò state sigillate in 50% glycerol (Sangon, # A600232) in PBS per l'imaghjini.L'imaghjini immunofluorescenti sò stati ottenuti cù un microscopiu confocale ZEISS LSM 900 Airyscan2 è u software ZNE 3.5.
Per l'imaghjini fluorescenti di l'ossigenu singlet, e cellule sò state lavate duie volte cù u buffer Hanks HEPES prima di aghjunghje 100 nM Si-DMA in u buffer Hanks HEPES (DOJINDO, # MT05).Dopu l'esposizione à a luce, i celi sò stati incubati in un incubatore di CO2 à 37 ° C per 45 minuti.E cellule sò state poi lavate duie volte cù u buffer HEPES di Hanks è cuntrastate cù Hoechst in u buffer HEPES di Hanks per 10 minuti à a temperatura di l'ambienti è visualizate cù un microscopiu confocale ZEISS LSM 900., #M36008) in buffer HBSS chì cuntene calcium è magnesiu.Dopu l'esposizione à a luce o a doxorubicina (MCE, #HY-15142A), i celluli sò stati incubati in un incubatore CO2 à 37 ° C per 10 minuti, lavatu duie volte cù buffer HBSS, è incubate cù Hoechst in buffer HBSS à a temperatura di l'ambienti.minuti.Doxorubicin hè stata aduprata cum'è un cuntrollu di sonda pusitivu induve e cellule sò state trattate cù 20 μM doxorubicin in HBSS chì cuntene 1% BSA per 30 min.L'imaghjini immunofluorescenti sò stati ottenuti cù un microscopiu cunfocale Zeiss LSM 900.
E cellule HEK293T chì esprimenu stabilmente mito-miniSOG sò state seminate à una densità di circa 30% in piatti di 15 cm.Dopu à 48 ore, quandu ~ 80% di cunfluenza hè stata righjunta, e cellule sò state lavate una volta cù PBS, incubate cù 1 mM Probe 3 in buffer HBSS frescu per 1 ora à 37 ° C è poi illuminate cù un LED blu per 10 minuti in stanza. temperatura..Dopu, e cellule sò state lavate duie volte cù PBS, scraped and resuspended in buffer PBS ghiacciatu chì cuntene inhibitori di proteasi senza EDTA (MCE, #HY-K0011).I celluli sò stati lysed sonicating the tip for 1 minute (1 second on and 1 second off at 35% amplitude).A mistura risultante hè stata centrifugata à 15,871 xg per 10 min à 4 ° C per caccià i detriti, è a cuncentrazione di supernatant hè stata aghjustata à 4 mg / mL cù un kit di analisi di proteina BCA (Beyotime, # P0009).Combina 1 ml di lisatu sopra cù 0,1 mM di biotina azide fotodegradabile (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM ligando TBTA (Aladdin, #T162437), è 1 mM CuSO4 incubatore cù fondu. rotazione per 1 ora à a temperatura di l'ambienti.Dopu una reazzione snap, aghjunghje a mistura à a suluzione pre-mixed (MeOH: CHCl3: H2O = 4 ml: 1 ml: 3 ml) in un vial di vetru 10 ml.I campioni sò stati mischiati è centrifugati à 4500 g per 10 minuti à a temperatura di l'ambienti.I suluzione inferiore è superiore sò stati scartati, u precipitatu hè lavatu duie volte cù 1 ml di metanolu è centrifugatu à 15871 × g per 5 min à 4 ° C.Aggiuncenu 1 ml di 8 M urea (Aladdin, no U111902) in 25 mM ammonium bicarbonate (ABC, Aladdin, no A110539) per dissolve u precipitatu.I campioni sò stati ricostituiti cù 10 mM dithiothreitol (Sangon, # A100281 in 25 mM ABC) per 40 minuti à 55 ° C seguita da l'aghjunzione di 15 mM di iodoacetamide fresca (Sangon, # A600539) à a temperatura di l'ambienti in u bughju.Alchilazione in 30 minuti..Un dithiothreitol 5 mM supplementu hè statu aghjuntu per piantà a reazione.Preparate circa 100 µl di perle di agarosio NeutrAvidin (Thermo, #29202) per ogni campione lavando 3 volte con 1 ml di PBS.A suluzione di proteome sopra hè stata diluita cù 5 ml di PBS è incubata cù perle d'agarose NeutrAvidin pre-lavate per 4 ore à a temperatura di l'ambienti.I perle sò stati poi lavati 3 volte cù 5 ml PBS chì cuntene 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 volte cù 5 ml PBS chì cuntene 1M urea, è 3 volte cù 5 ml ddH2O.I granuli sò stati poi raccolti per centrifugazione è risospesi in 200 μl di 25 mM ABC contenente 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, # C805228) è 20 ng / μl tripsina (Promega, # V5280).Trypsinize durante a notte à 37 ° C cù rotazione.A reazione hè stata fermata aghjunghjendu l'acidu formicu (Thermo, # A117-50) finu à chì u pH hà righjuntu 2-3.I perle sò lavati 3 volte cù 1 ml di PBS chì cuntene 0,2% SDS, 3 volte cù 1 ml di PBS chì cuntene 1 M urea, è dopu 3 volte cù 1 ml d'acqua distillata.I peptidi modificati sò stati liberati da lisi ligera (365 nm) per 90 min usendu 200 μl di 70% MeOH.Dopu a centrifugazione, u supernatant hè stata cullata.I perle sò stati poi lavati una volta cù 100 μl di 70% MeOH è i supernatanti sò stati riuniti.I campioni sò stati secchi in un concentratore di vacuum Speedvac è almacenati à -20 ° C finu à l'analisi.
Per identificà è quantificà i peptidi mudificati di l'ossigenu singlet, i campioni sò stati ridissolti in 0.1% d'acidu formicu è 1 μg di peptidi sò stati analizati utilizendu un spettrometru di massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid equipatu di una fonte nano ESI da Tune è Xcalibur da u software venditore 4.3.I campioni sò stati separati nantu à una colonna capillare 75 µm × 15 cm internamente imballata cù materiale C18 3 µm (ReproSil-pur, # r13.b9.) è cunnessi à un sistema EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).I peptidi sò stati separati da cromatografia di gradiente lineare di 95 minuti da 8% di solvente B à 50% di solvente B (A = 0.1% d'acidu formicu in acqua, B = 0.1% d'acidu formicu in 80% di acetonitrile), dopu aumentatu linearmente à 98% B min. in 6 min à un flussu di 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos raccoglie dati alternativamente tra scansione MS completa e scansione MS2 in base ai dati.A tensione di sputtering hè stata stabilita à 2,1 kV è a temperatura di u capillare di trasportu di ioni era 320 ° C.Spettri MS (350-2000 m/z) sò stati cullati cù una risoluzione di 120,000, AGC 4 × 105, è un tempu massimu di input di 150 ms.I 10 precursori di carica multiplici più cumuni in ogni scansione completa sò stati frammentati cù HCD cù una energia di collisione normalizzata di 30%, una finestra di isolamentu quadrupole di 1.6 m / z, è una risoluzione di 30,000.Un target AGC per spettrometria di massa in tandem utilizendu 5 × 104 è u tempu massimu di input 150 ms.L'eccezzioni dinamica hè stabilita à 30 seconde. Ioni non assignati o quelli cù una carica di 1+ è> 7+ sò stati rifiutati per MS / MS. Ioni non assignati o quelli cù una carica di 1+ è> 7+ sò stati rifiutati per MS / MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ioni non assignati o ioni cù una carica di 1+ è> 7+ sò stati rifiutati per MS / MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ioni senza specificazione o ioni cù carichi di 1+ è> 7+ sò stati rifiutati per MS / MS.
I dati grezzi sò trattati cù a piattaforma di computing FragPipe basatu annantu à MSFragger.I preghjudizii di massa è l'aminoacidi currispondenti sò stati determinati utilizendu un algoritmu di ricerca aperta cù una toleranza di massa precursore di -150 à 500 Da.I peptidi mudificati sò stati identificati cù mudificazione di histidine cù guadagni di massa di + 229.0964 è + 247.1069 Da in PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
E cellule chì esprimenu in modu stabile u genu miniSOG fusu sò stati placcati in piatti di 6 cm.À a cunfluenza di ~ 80%, e cellule sò state lavate una volta cù HBSS (Gibco, #14025092), poi incubate cù sonde chimiche in HBSS per 1 ora à 37 ° C è illuminate cù luce blu.10W LED per 20 minuti à a temperatura di l'ambienti.Per determinar quale tipu di spezie di ossigenu reattivu hè implicatu in PDPL, 0.5 mM vitamina C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 sò stati aghjuntu à e cellule cum'è supplementi.Dopu avè lavatu cù PBS friddu, e cellule sò state scraped, cullate in tubi di centrifuga di 1,5 ml, è sonicate cù una punta per 1 min in 200 μl di PBS cù 1x inhibitore di proteasi senza EDTA (1 s è 1 s senza, amplitude 35%).A mistura risultante hè stata centrifugata à 15,871 × g per 10 min à 4 ° C è a cuncentrazione di supernatant hè stata aghjustata à 1 mg / mL cù un kit di test di proteina BCA.Circa 50 µl di u lisatu sopra hè incubatu cù 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM ligand TBTA, è 1 mM CuSO4 per 1 ora à a temperatura di l'ambienti cù rotazione da u fondu à u cima.Dopu a reazione di clic, a precipitazione cù l'acetone hè stata realizata aghjunghjendu 250 μl di acetone pre-chilled à i campioni, incubazione à -20 ° C per 20 min è centrifugazione à 6010 × g per 10 min à 4 ° C.Raccogliere u pellet è ebollizione in 50 µl di 1x tampone di Laemmli per 10 min à 95 ° C.I campioni sò stati poi analizzati nantu à i geli longhi SDS-PAGE è visualizati cù u sistema di imaging Bio-rad ChemiDoc MP Touch cù u software Image Lab Touch.
L'espressione è a purificazione di a proteina recombinante miniSOG-6xHis hè stata fatta cum'è descritta prima.In breve, E. coli BL21 (DE3) cells (TransGen, # CD701-02) sò stati trasfurmati cù pET21a-miniSOG-6xHis è l'espressione di a proteina hè stata indutta cù 0.5 mM IPTG (Sangon, # A600168).Dopu à a lisi di cellula, i proteini sò purificati cù perle d'agarose Ni-NTA (MCE, n ° 70666), dializatu contr'à PBS, è almacenatu à -80 ° C.
Per un test di prossimità di etichetta in vitro basato su anticorpi, mischiare 100 μM miniSOG purificato, 1 mM sonda 3 e 1 μg di anticorpo monoclonale di mouse anti-etichetta (TransGen, # HT501-01) in PBS per un volume di reazione totale di 50 μl..A mistura di reazzione hè stata irradiata cù luce LED blu per 0, 2, 5, 10 è 20 min à a temperatura di l'ambienti.A mistura hè stata incubata cù 0,1 mM di biotina-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM ligand TBTA, è 1 mM CuSO4 per 1 h à a temperatura di l'ambienti in un agitatore di movimentu ascendenti.Dopu una reazione rapida, aghjunghje 4x tampon di Laemmli direttamente à a mistura è bolliri à 95 ° C per 10 min.I campioni sò stati analizati nantu à i gel SDS-PAGE è analizati da western blotting cù streptavidin-HRP (1: 1000, Solarbio, #SE068).
Un peptide sinteticu chì cuntene istidina cù amidazione C-terminale (LHDALDAK-CONH2) hè stata utilizata per analizà l'etichettatura in vitro basata in peptide vicinu.In questa prova, 100 μM miniSOG purificato, 10 mM sonda 3 e 2 μg/ml di peptide sintetico sono stati mischiati in PBS in un volume di reazione totale di 50 μl.A mistura di reazzione hè stata irradiata cù luce LED blu per 1 ora à a temperatura di l'ambienti.Un microlitru di mostra hè statu analizatu cù un sistema LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight spettrometru di massa cù u software di analisi di spettru MassLynx).
E cellule HEK293T chì esprimenu stabilmente u genu di fusione miniSOG sò state seminate in piatti di 10 cm per linee cù diverse localizzazioni d'organu (Mito, ER, Nucleus) è piatti di 15 cm per linee Parkin-miniSOG è BRD4-miniSOG.À a cunfluenza di ~ 90%, e cellule sò lavate una volta cù HBSS, poi incubate cù a sonda 3 in HBSS per 1 ora à 37 ° C è illuminate cù un LED blu 10 W à a temperatura di l'ambienti.Per l'etichettatura senza cuntattu di Parkin, 10 µM di proton carbonyl cyanide carrier m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) cù a sonda 3 in HBSS hè stata aghjuntu per 1 ora à 37 ° C.A lisi cellulare, a chimica di clic, i passi di riduzzione è di alchilazione eranu i stessi discritti sopra, salvu chì 2 mg di lisatu sò stati aghjuntu è biotin PEG3 azide hè stata utilizata in a reazione di clicu invece di biotina azide fotodegradable.Dopu l'arricchimentu, i perle sò lavati 3 volte cù 5 ml di PBS chì cuntenenu 0,2% SDS, 3 volte cù 5 ml di PBS chì cuntene 1 M urea, è 3 volte cù 5 ml di PBS.Successivamente, 2 µg di tripsina sono stati aggiunti a 300 µl di ABC 25 mM contenenti 1 M di urea per scindere la proteina durante la notte a 37 °C.A reazione hè stata fermata aghjunghjendu l'acidu formicu finu à un pH di 2-3.Dopu a tripsinizazione nantu à perle, a suluzione di peptide hè stata dessalata cù una colonna SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) è secca in un concentratore di vacu Speedvac.I peptidi sò stati risolti in 0.1% àcitu formicu è 500 ng di peptidi sò stati analizati cù un spettrometru di massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid equipatu cù a fonte nano-ESI descritta sopra.I peptidi sò stati siparati nantu à precolumns RP-HPLC cummerciale (75 μm x 2 cm) (Thermo, n ° 164946) è e colonne analitiche RP-HPLC (75 µm x 25 cm) (Thermo, n ° 164941), tramindui pieni di 2 µm.gradiente da 8% à 35% ACN in 60 minuti, poi linearmente aumentatu à 98% B in 6 minuti à un flussu di 300 Nl/min.Spettri MS (350-1500 m / z) sò stati cullati cù una risoluzione di 60,000, AGC 4 × 105, è un tempu massimu di input di 50 ms.L'ioni selezziunati sò stati fragmentati sequenzialmente da HCD in cicli di 3 s cù una energia di collisione normalizzata di 30%, una finestra di isolamentu quadrupole di 1,6 m / z, è una risuluzione di 15000. Un spettrometru di massa tandem 5 × 104 target AGC è un tempu massimu di iniezione. di 22 ms sò stati usati.L'esclusione dinamica hè stabilita à 45 seconde. Ioni non assignati o quelli cù una carica di 1+ è> 7+ sò stati rifiutati per MS / MS. Ioni non assignati o quelli cù una carica di 1+ è> 7+ sò stati rifiutati per MS / MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ioni non assignati o ioni cù una carica di 1+ è> 7+ sò stati rifiutati per MS / MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ioni senza specificazione o ioni cù carichi di 1+ è> 7+ sò stati rifiutati per MS / MS.
I passi di preparazione di mostra finu à l'arricchimentu di e perle di NeutrAvidin eranu listessi in l'analisi LC-MS / MS descritte sopra.Circa 50 μg di lisatu sò stati utilizati com'è input per u cuntrollu di carica è 2 mg di lisatu sò stati utilizati per reazzioni di clic.Dopu à arricchimentu è lavatu cù neutravidin, i prutiìni bound sò eluted da agghiuncennu 50 μl di buffer di Laemmli à i perle di resina agarose è fogghiu a 95 ° C. per 5 minuti.L'input di carica di cuntrollu è i campioni arricchiti di perle sò stati analizati da SDS-PAGE è trasferiti à membrane PVDF (Millipore, #ISEQ00010) da i metudi di Western blot standard.I membrani sò stati bluccati cù 5% di latte scrematu (Sangon, #A600669) in TBS chì cuntene 0.1% tween-20 (TBST) è incubate sequentially cù anticorpi primari è secundarii.L'anticorpi primari sò stati diluiti 1: 1000 in 5% di latte scrematu in TBST è incubati durante a notte à 4 ° C.L'anticorpi secundarii sò stati usati in una proporzione di 1: 5000 è incubati per 1 ora à a temperatura di l'ambienti.I membrani sò stati visualizati da chimiluminescenza cù u sistema di imaging Chemidoc MP.Tutti i scans uncut di blots è gels in a figura sò presentati cum'è dati crudi.
L'anticorpi primari utilizati in stu studiu includenu l'anticorpu monoclonale di cunigliu anti-SFPQ (CST, n ° 71992), l'anticorpu monoclonale di cunigliu anti-FUS (CST, n. AP), anticorpi policlonali anti-mSin3A di coniglio (Abcam, #ab3479), anticorpi monoclonali anti-tag di mouse (TransGen, #HT201-02), anticorpi monoclonali anti-β-actin di mouse (TransGen, #HC201-01), anti-tag di coniglio -CDK2 anticorpo monoclonale (ABclonal, #A0094), anticorpo monoclonale di coniglio a CTBP1 (ABclonal, #A11600), anticorpo policlonale di coniglio a DUT (ABclonal, #A2901), anticorpo policlonale di coniglio a PSMC4 (ABclonal, #A2505), anti- DNAJB1 anticorpu policlonali (ABclonal, # A5504).Questi anticorpi sò stati utilizati à una diluzione 1: 1000 in 5% di latte scrematu in TBST.L'anticorpi secundari utilizati in stu studiu includenu IgG anti-rabbit (TransGen, # HS101-01), IgG anti-mouse (TransGen, # HS201-01) à una diluzione 1: 5000.
Per investigà ulteriormente se BRD4 interagisce cù SFPQ, e cellule stabili HEK293T è BRD4-miniSOG chì sovraesprimenu HEK293T sò state placcate in piatti di 10 cm.I celluli sò stati lavati cù PBS friddu è lisi in 1 ml di tampone di lisi Pierce IP (Thermo Fisher, # 87787) cun inhibitore di proteasi senza EDTA per 30 minuti à 4 ° C.Dopu quì, i lisati sò stati cullati in tubi di centrifuga da 1,5 ml è centrifugati à 15.871 xg per 10 min à 4 ° C.U surnatante hè stata raccolta è incubata cù 5 µg di anticorpu monoclonale di mouse marcatu anti-V5 (CST, #80076) durante a notte à 4 ° C.Lavare circa 50 µl di perle magnetiche di proteina A/G (MCE, #HY-K0202) due volte con PBS contenente 0,5% Tween-20.Allora i lisati di cellula sò stati incubati cù perle magnetichi per 4 ore à 4 ° C cù rotazione da u fondu à u cima.Allora i perle sò lavati quattru volte cù 1 ml di buffer PBST è bolliti à 95 ° C per 5 min.I campioni sò stati analizati nantu à i gel SDS-PAGE è trasferiti à membrane PVDF cù i metudi standard di Western blot.I membrani sò stati bluccati in 5% di latte scrematu in TBST è incubati sequenzialmente cù anticorpi primari è secundarii.Primary Antibody Rabbit anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, #71992) hè stata utilizata in una proporzione di 1: 1000 in 5% di latte scrematu in TBST è incubata durante a notte à 4 ° C.L'IgG anti-cunigliu hè stata utilizata in una proporzione di 1: 5000 è incubata per 1 ora à a temperatura di l'ambienti.I membrani sò stati visualizati da chimiluminescenza cù u sistema di imaging Chemidoc MP.
Tutte e strutture aduprate per l'analisi di l'Area di Superficie Accessibile di Solvente (SASA) sò state ottenute da u Protein Data Bank (PDB)52 o a AlphaFold Protein Structure Database53.U SASA assolutu hè statu calculatu per ogni residuu cù u prugramma FreeSASA.Solu i dati SASA cumpleti è senza ambiguità per l'histidine marcatu è i so vicini sò stati utilizati per ottene u SASA mediu per ogni struttura.L'accessibilità di solvente relative (RSA) per ogni histidina hè stata calculata dividendu u valore SASA assolutu da a superficia di a superficia di residuu empirica massima pussibule dispunibile per u solvente.Tutte l'histidine sò state allora classificate cum'è nascoste se u RSA mediu era sottu à 20%, altrimenti esposti56.
I fugliali crudi ottenuti in modu DDA sò stati cercati cù Proteome Discoverer (v2.5) o MSfragger (Fragpipe v15.0) in a basa di dati di prutezione verificata SwissProt chì cuntene contaminanti cumuni.I peptidi necessitanu tripsina cumpleta cù dui siti di scissione mancanti, a metilazione di carbamoil cum'è una mudificazione fissa è l'ossidazione di metionina cum'è una mudificazione dinamica.A tolleranza di u pesu di u precursore è di u frammentu hè stata stabilita à 10 ppm è 0,02 Da (MS2 Orbitrap), rispettivamente. I colpi di contaminanti sò stati eliminati, è i proteini sò stati filtrati per ottene una falsa scuperta di scuperta di <1%. I colpi di contaminanti sò stati eliminati, è i proteini sò stati filtrati per ottene una falsa scuperta di scuperta di <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы полубы полуфчо%. I colpi di contaminanti sò stati eliminati è i proteini filtrati per dà un tassu di deteczione falsa di <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижеств были удалены, а белки отфильтрованы для достижеств были удалены. I colpi di contaminanti sò stati eliminati è i proteini filtrati per ottene una tarifa falsa positiva di <1%.Per l'analisi quantitativa senza l'usu di etichette, u cuntenutu di proteina normalizatu da trè ripetizioni biologiche hè stata utilizata.L'analisi di localizazione subcellulare di a proteina hè stata realizata cù l'analisi di Gene Ontology (GO) da DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 è basa di dati compilati è publicati da u gruppu Alice Ting.A mappa di u vulcanu hè stata ottenuta da Perseus (v1.6.15.0). I cambiamenti di l'abbundanza di a proteina sò stati pruvati per a significazione statistica utilizendu un test t bifacciale, è i successi di a proteina sò stati identificati cù un cambiamentu di abbundanza> 2 (salvo altrimenti dichjaratu) è u valore p <0,05. I cambiamenti di l'abbundanza di a proteina sò stati pruvati per a significazione statistica utilizendu un test t bifacciale, è i successi di a proteina sò stati identificati cù un cambiamentu di abbundanza> 2 (salvo altrimenti dichjaratu) è u valore p <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. I cambiamenti di u cuntenutu di a proteina sò stati pruvati per a significazione statistica utilizendu un test t di dui coda, è i partiti di prutezione sò stati identificati cù u cambiamentu di cuntenutu> 2 (salvo altrimenti nutatu) è u valore ap <0.05.使用 双边 T 检验 测 测 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 确定 的 命命 的 丰度 另> 2 (除非 另 蛋白质 说明) 和 P 值 <0,05.使用 双边 T 检验 蛋白质 测 蛋白质 倍 倍 变化 确定 蛋白质 命 中 的 丰度丰度> 2 (另 有 说明) 和 P值 <0,05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. U significatu statisticu di i cambiamenti in u cuntenutu di a proteina hè stata pruvata utilizendu un test t à dui coda, è i partiti di proteina sò stati determinati per i cambiamenti di cuntenutu> 2 (salvo altrimenti indicatu) è p-value <0,05.L'analisi di l'interazzione di a proteina hè stata realizata cù l'analisi GO cù a basa di dati String.
Trè replicati biologichi sò stati realizati cù risultati simili.L'analisi statistiche hè stata fatta cù GraphPad Prism (software GraphPad) è i parcelle di u vulcanu sò stati generati cù Perseus (v1.6.15.0).Per paragunà i dui gruppi, i valori p sò stati determinati utilizendu un test t di Studente à duie code.Solu i proteini singleton identificati almenu duie volte in u gruppu sperimentale sò stati inclusi in i parcelle di u vulcano, è i valori mancanti currispundenti in u gruppu di cuntrollu sò stati rimpiazzati cù Perseus da una distribuzione normale per chì u p-value puderia esse calculatu.E barre d'errore rapprisentanu a media ± deviazione standard.In l'analisi proteomica per l'analisi statistiche, l'abbundanza di proteine ​​​​apparsu in almenu dui replicati biologichi hè stata mantenuta.I metudi statistichi ùn sò micca stati usati per predeterminate a dimensione di mostra.L'esperimenti ùn sò micca casuali.I circadori ùn anu micca cecu à i travaglii durante l'esperimentu è a valutazione di i risultati.
Per più infurmazione nantu à u disignu di studiu, vede l'abstrattu di u Rapportu di Ricerca di Natura ligata à questu articulu.
I dati di spettrometria di massa ottenuti in stu studiu sò stati sottumessi à u ProteomeXchange Consortium via u repository partner iProX57 sottu dataset ID PXD034811 (PDPL-MS dataset).I dati crudi sò furniti in forma di schedarii di dati crudi.Questu articulu furnisce i dati originali.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Cunniscenza di u vicinatu: utilizendu a biotinilazione dipendente da a vicinanza per caratterizà i cumplessi di proteine ​​​​è l'organu di mappa. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Cunniscenza di u vicinatu: utilizendu a biotinilazione dipendente da a vicinanza per caratterizà i cumplessi di proteine ​​​​è l'organu di mappa.Gingras, AS, Abe, KT è Raut, B. Familiarità cù l'ambienti: utilizendu a biotinilazione dipendente da a vicinanza per caratterizà i cumplessi di proteine ​​​​è l'organuli di mappa. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并绘合物并绘绘 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Capisce u vicinatu: aduprà a dependenza di u vicinatu à a vita biologica.Gingras, AS, Abe, KT è Raut, B. Capisce a vicinanza: carattarizazione di cumplessi di proteine ​​​​è mapping of organelles usendu a biotinilazione dipendente da a vicinanza.currente.A mo opinione.Chimica.biologia 48, 44-54 (2019).
Geri, JB et al.Cartografia di u microambientu trasfirendu l'energia di Dexter à e cellule immune.Scienza 367, 1091-1097 (2020).
Hertling, EL et al.E rete di scala di dui proteomi rilevanu a rimodellazione specifica di e cellule di l'interattumu umanu.Cells 184, 3022-3040.e3028 (2021).