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Strategie di diagnostica tradiziunali per a rilevazione di e malatie infettive necessitanu l'usu di strumenti di bancu chì ùn sò micca adattati per a prova di u puntu di cura (POCT).A microfluidica emergente hè una tecnulugia altamente miniaturizzata, automatizata è integrata chì hè una alternativa potenziale à i metudi tradiziunali per diagnostichi in situ veloci, à pocu costu è precisi.I metudi di diagnostichi moleculari sò largamente usati in i dispositi microfluidichi cum'è i metudi più efficaci per a rilevazione di patogeni.Questa rivista riassume i recenti progressi in a diagnostica moleculare basata in microfluidica di e malatie infettive da una perspettiva accademica è industriale.Prima, descrivimu un prucessu tipicu in chip di l'acidi nucleici, cumprese pretrattamentu di mostra, amplificazione è lettura di signali.E caratteristiche, vantaghji è svantaghji di i quattru tippi di piattaforme microfluidique sò allora paragunati.In seguitu, discuteremu l'usu di saggi digitali per a quantificazione assoluta di l'acidi nucleici.I dispusitivi di diagnostica moleculare basati in microfluidichi classici è recenti sò riassunti cum'è evidenza di u statu attuale di u mercatu.Infine, prupunemu direzzione futura per u diagnosticu microfluidic di e malatie infettive.
I malatii infizziosi sò causati da i patogeni, cumprese battìri, virus è parassiti, chì sò distribuiti in u mondu sanu.A cuntrariu di l'altri malatii, i patogeni sò rapidamente infettati è si sparghje trà l'omu è l'animali d'ospiti attraversu l'inoculazione, l'aria è l'acqua [1].A prevenzione di e malatie infettive hè critica cum'è una misura di salute publica.Trè strategie principali per a lotta di e malatie infettive: (1) cuntrullà a fonte di l'infezzione;(2) interruzzione di a strada di trasmissione;(3) prutezzione di pupulazioni suscettibili.Trà e strategie principali, u cuntrollu di a surgente di l'infezzione hè cunsideratu a strategia più impurtante per via di a so cunvenzione è u prezzu bassu.U diagnosticu rapidu, l'isolamentu è u trattamentu di l'individui infettati sò critichi, chì necessitanu strategie di diagnostichi veloci, sensitivi è precisi [2].U diagnosticu attuale di e malatie infettive di solitu combina l'esame clinicu basatu annantu à i segni è sintomi è studii di laboratoriu cum'è a cultura cellulare è a diagnostica moleculare, chì necessitanu persunale furmatu, prucessi intensivi di travagliu è equipaghji di teste caru [3, 4].A prevenzione di epidemie di malatie infettive richiede un diagnosticu lucale rapidu, prezzu è precisu, soprattuttu in i zoni limitati di risorse induve e malatie infettive sò cumuni è gravi [5], è ancu trattamentu in u desertu o in u campu di battaglia, induve l'emergenze sò imprevisible..l'assistenza medica hè limitata [6].In questu cuntestu, a microfluidica hè una tecnulugia chì combina tecnulugia di sistemi microelettromeccanici, nanotecnologia o scienza di i materiali per a manipulazione precisa di fluidi [7,8,9,10], chì furnisce novi pussibulità per a rilevazione di u puntu di cura (POCT).) agenti infettivi fora di ospedali è laboratorii.Paragunatu à i diagnostichi tradiziunali di tempu, a tecnulugia microfluidica offre un risparmiu di campioni è di costu per a diagnostica moleculare durante i focu di e malatie.A diffusione globale di a malatia coronavirus 2019 (COVID-19) hè causata da u sindromu respiratoriu agutu severu coronavirus 2 (SARS-CoV-2), cusì l'impurtanza di a microfluidica per a prevenzione è u cuntrollu puntuale di a pandemia hè di novu enfatizzata [11, 12]. , 13].A cuntrariu di i diagnostichi tradiziunali, u microfluidic POCT usa picculi dispositi portatili chì varienu da l'analizzatori di banco à i picculi strisce di prova laterali per pruvà vicinu à u puntu di campionamentu [14].Queste teste presentanu una preparazione simplista o senza mostra, amplificazione rapida di u signale, è letture di signali sensibili chì risultanu in brevi durazioni è risultati precisi in pochi minuti.A dispunibilità è a pruduzzione in massa di strumenti di assistenza sanitaria basati in microfluidi anu allargatu e so applicazioni diagnostiche dirette è dirette fora di l'uspidale, vicinu à u paziente, è ancu in casa.
Trà e strategie esistenti per diagnosticà e malatie infettive, u diagnosticu moleculare hè unu di i più sensibili [15, 16].Inoltre, a diagnostica moleculare hè spessu usata cum'è standard d'oru per a rilevazione continua di COVID-19, chì permette a rilevazione diretta di e regioni specifiche di virus di RNA o DNA prima di l'iniziu di una risposta immune [17, 18].In a rivista attuale, prisentamu l'ultimi avanzati in i prucessi di diagnostichi moleculari basati in microfluidica per e malatie infizziosi, da una perspettiva accademica à perspettivi industriali futuri (Fig. 1).Cuminceremu cù trè passi chjave in a rilevazione di l'acidu nucleicu: pretrattamentu di campioni in chip, amplificazione di l'acidu nucleicu è lettura di signali.Dopu avemu paragunatu diverse tippi di piattaforme microfluidiche cù a so struttura è a so funzione, chì mostranu caratteristiche uniche (punti di forza è debule).A rilevazione di l'acidu nucleicu digitale hè più discututa è datu cum'è un esempiu di una tecnulugia di terza generazione per a quantificazione assoluta di molécule di patogeni infizziosi.Inoltre, parechji dispositi POCT cummirciali tipici è più recenti seranu presentati per dimustrà u statu attuale di u mercatu POCT microfluidic per a diagnostica moleculare.Discuteremu è spiegheremu ancu a nostra visione per l'applicazioni future.
I moduli di chip microfluidichi per a rilevazione di l'acidu nucleicu ponu esse divisi in trè categurie (campionamentu, ricunniscenza è signalazione) secondu e so funzioni [19].Trà questi moduli, u modulu di campionamentu realiza principalmente a lisi di mostra è l'estrazione di l'acidu nucleicu.U modulu di sensori cuntrolla principarmenti a cunversione è l'amplificazione di i signali di l'acidu nucleicu.U modulu di signalazione rileva u signale cunvertitu è ​​processatu da u modulu di sensazione.Basatu nantu à u prucessu di deteczione di l'acidi nucleici nantu à un chip, riassumeremu e diverse chips chì ponu realizà a funzione "input and output".
U primu passu in a rilevazione di l'acidu nucleicu hè l'estrazione di l'acidu nucleicu, vale à dì isolà l'acidu nucleicu di destinazione da a mostra originale.L'estrazione di l'acidu nucleicu hè realizatu per purificà l'acidi nucleici da altri contaminanti molecolari, assicurà l'integrità di a struttura primaria di molécule d'acidu nucleicu, è ottimisà i risultati.L'estrazione di l'acidu nucleicu richiede a lisi di mostra necessaria è a cattura di l'acidu nucleicu, a qualità è l'efficienza di quale anu un impattu enormu nantu à a ricerca è i risultati di diagnostichi.Ogni effetti secundarii sottili durante l'estrazione pò limità più deteczione.Per esempiu, i metudi di a reazione di a catena di polimerasi (PCR) è di l'amplificazione isotermica di loop (LAMP) sò inibiti da certi solventi organici residuali, cum'è l'etanol è l'isopropanol in reagenti di isolamentu di l'acidu nucleicu [20].L'estrazione liquidu-liquidu è l'estrazione in fase solida sò i metudi più populari per isolà l'acidi nucleici [21], in ogni modu, l'estrazione liquidu-liquidu nantu à un chip hè estremamente limitata, postu chì i reagenti utilizati in l'estrazione liquidu-liquidu causanu corrosione di a maiò parte di chip microfluidichi. .Quì, mettemu in risaltu i metudi di estrazione in fase solida basati in microarray è paragunemu i so vantaghji è i svantaghji.
U siliciu hè un materiale di sustrato cumpatibile cù l'acidi nucleici per via di a so biocompatibilità, stabilità è facilità di mudificazione [22].Impurtante, quandu mudificatu cù silice o altri materiali, stu compositu mostra proprietà per adsorbe l'acidi nucleici caricati negativamente in condizioni di pH bassu, altu sali mentre eluting cun pH elevatu, soluzioni di sali bassi.Basatu nantu à stu fenominu, hè pussibule purificà l'acidu nucleicu.
Diverse forme di materiali basati in silice sò stati aduprati per l'estrazione di l'acidu nucleicu in microfluidica, cum'è perle di silice, polveri, filtri di microfibra è membrane di silice [23, 24, 25, 26].Sicondu e proprietà di u materiale, i materiali basati in siliciu ponu esse utilizati in i microcircuiti in diverse manere.Per esempiu, granuli di silice, polveri è nanofiltri cummirciali ponu esse simpliciamente posti in i pori o microcanali di chips microfluidichi è aiutanu à estrattà l'acidi nucleici da e mostre [27, 28, 29].E membrani di silice modificate in superficia ponu ancu esse aduprate per purificà rapidamente l'ADN da i patogeni à pocu costu.Per esempiu, Wang et al.[30] Cumminendu reazzioni di amplificazione di denaturazione cù scambii di catene mediati da vesicula cù membrani di silice rivestite cù oligosaccharidi di chitosanu, hè statu introduttu un sistema portatile versatile chì hà rilevatu cù successu 102-108 unità di furmazione di colonie.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., è a prisenza di u virus era facilmente visibile.Powell et al.[31] I microarrays basati in siliciu sò stati allora utilizati per detectà u virus di l'epatite C (HCV), u virus di l'immunodeficienza umana (HIV), u virus Zika è u papillomavirus umanu è a propagazione automatica, in quale un microreattore tortuoso di 1,3 μl hè statu sviluppatu per catturà virus RNA.ed eseguire l'amplificazione in situ.In più di questi metudi, i microcolumns di silice mudificate in superficia ghjucanu ancu un rolu chjave in l'estrazione di l'acidu nucleicu, postu chì a geometria è e proprietà di u materiale mudificatu aumentanu assai l'efficienza di estrazione.Chen et al.[32] hà prupostu una piattaforma microfluidica per l'isolamentu di l'RNA di bassa cuncentrazione basata nantu à microcolumns di silicio rivestite di amino.Stu dispusitivu microfluidic integra un array di micropillars 0.25 cm2 nantu à un sustrato di siliciu per ottene una efficienza di estrazione più alta per mezu di un designu di rapportu di superficia à u voluminu elevatu.U vantaghju di stu disignu hè chì u dispusitivu microfluidic pò ghjunghje sin'à 95% di efficienza di estrazione di l'acidu nucleicu.Queste strategie basate in siliciu dimustranu u valore di l'isulazione rapida di l'acidi nucleici à pocu costu.In cumbinazione cù chips microfluidichi, strategie di estrazione basate in siliciu ponu micca solu aumentà l'efficienza di a rilevazione di l'acidu nucleicu, ma ancu facilità a miniaturizazione è l'integrazione di i dispositi analitici [20].
I metudi di separazione magnetica utilizanu particeddi magnetichi per isolà l'acidi nucleici in presenza di un campu magneticu esternu.Particelle magnetiche cumunimenti usate include Fe3O4 o γ-Fe2O3 particelle magnetiche rivestite di silice, amino è carboxyl [33,34,35,36].A caratteristica distintiva di particeddi magnetichi paragunate à i metudi SPE basati in siliciu hè a facilità di manipulazione è cuntrollu cù magneti esterni.
Utilizendu l'interazzione elettrostatica trà l'acidi nucleici è a silice, in cundizioni di sali altu è pH bassu, l'acidi nucleici sò adsorbiti nantu à a superficia di particelle magnetiche rivestite di silice, mentre chì in cundizioni di sali bassi è pH altu, e molécule ponu esse lavate. di novu..Perle magnetiche rivestite di silice permettenu di estrarre l'ADN da campioni di volumi grossi (400 μL) utilizendu un muvimentu cuntrullatu magneticamente [37].Comu dimustrazione, Rodriguez-Mateos et al.[38] hà utilizatu magneti sintonizzabili per cuntrullà u trasferimentu di perle magnetiche à diverse camere.Basatu nantu à particelle magnetiche rivestite di silice, 470 copie / mL di RNA genomicu SARS-CoV-2 ponu esse estratti da campioni di acque reflue per a rilevazione di trascrizione inversa LAMP (RT-LAMP) è a risposta pò esse letta in 1 ora.ochju nudu (Fig. 2a).
Dispositivi basati nantu à materiali magnetichi è porosi.Schema conceptuale di u dispositivu microfluidic IFAST RT-LAMP per a rilevazione di RNA SARS-CoV-2 (adattatu da [38]).b Microdispositivu centrifugu per dSPE di l'acidu nucleicu di tampone buccale (adattatu da [39]).c Concentratore di campioni autoalimentatu integratu cù una carta FTA® (adattata da [50]).d Carta di filtru Fusion 5 mudificatu cù chitosan (adattatu da [51]).SARS-CoV-2 sindrome respiratorio acuto severo coronavirus 2, amplificazione isotermica mediata da loop di trascrizione inversa RT-LAMP, partner tecnologici di ricerca FTA, acidi nucleici NA
Particelle magnetiche caricate positivamente sò ideali per attaccà a spina di fosfate di un acidu nucleicu.À una certa cuncentrazione di sali, i gruppi di fosfati caricati negativamente di l'acidi nucleici ponu esse caricati positivamente nantu à a superficia di e particelle cumposti magnetichi.Dunque, i nanoparticuli magnetichi cù una superficia rugosa è una alta densità di gruppi amminichi sò stati sviluppati per l'estrazione di l'acidi nucleici.Dopu a separazione magnetica è u bloccu, i nanoparticuli magnetichi è i complexi di DNA ponu esse direttamente utilizati in a PCR, chì elimina a necessità di operazioni di purificazione è di eluzione cumplessi è di tempu [35].Nanoparticles magnetichi rivestiti cù gruppi carboxyl negativi sò stati ancu usati per separà l'acidi nucleici adsorbiti nantu à a superficia in polietilenglicol d'alta concentrazione è suluzioni di clorur di sodiu [36].Cù queste perle magnetiche modificate in superficia, l'estrazione di DNA hè cumpatibile cù l'amplificazione sussegwenti.Dignan et al.[39] hà descrittu una piattaforma microfluidica centrifuga automatizata è portatile per u pretrattamentu di l'acidu nucleicu, chì permette à u persunale non tècnicu di usà in situ.Inoltre, a cumpatibilità di l'ADN isolatu cù LAMP, un metudu adattatu per l'analisi di l'acidu nucleicu di u puntu di cura, demustra ancu i requisiti minimi di l'equipaggiu è l'adattabilità per l'assai colorimetrici (Fig. 2b).
I metudi di perle magnetichi offrenu a pussibilità di l'estrazione automatizata, alcune di e quali esistenu in extractori d'acidu nucleicu automatizatu cummerciale [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, USA), QIAcube® HT;CapitalBio (Beijing, Cina) è Biomek®;Beckman (Miami, USA).), Florida, USA)].I vantaghji di cumminà perle magnetiche cù microfluidichi ponu esse aduprati per l'estrazione automatizata efficiente di l'acidi nucleici, chì puderanu avanzà u sviluppu di diagnostichi moleculari;in ogni modu, a cumminazzioni di perle magnetichi cù microfluidics sempre s'appoghja assai nantu à i sistemi di cuntrollu cumplessu per a manipulazione precisa di perle magnetiche, chì spiega a popularità di i prudutti cummirciali chì sò voluminosi è caru, chì limita l'appiecazione ulteriore di perle magnetiche in POCT.
Diversi materiali porosi, cum'è filtri di nitrocellulosa mudificate, carte Finders Technology Associates (FTA), carte di filtri basati in polietersulfone, è materiali rivestiti di glicani sò stati ancu usati per a rilevazione di l'acidu nucleicu [40, 41, 42, 43, 44].I materiali fibrusi porosi, cum'è a carta fibru, sò stati prima utilizati per isolà l'ADN entangling fisicamente e molécule d'ADN à filamentu longu cù fibre.I pori chjuchi portanu à una forte restrizione fisica di e molécule di DNA, chì influenza positivamente l'estrazione di DNA.A causa di e diverse dimensioni di pori di carta fibru, l'efficienza di estrazione ùn pò micca risponde à i bisogni di l'amplificazione di l'ADN [45, 46].A carta FTA hè una carta di filtru cummerciale utilizata in u campu di a medicina forensica è largamente usata in altri spazii di diagnostichi moleculari.Per mezu di l'usu di carta di filtru di cellulosa impregnata cù diversi sustanzi chimichi per lisà e membrane di e cellule in u campione, l'ADN liberatu hè prutettu da a degradazione finu à 2 anni.Più recentemente, a carta di cellulosa impregnata hè stata sviluppata per a rilevazione moleculare di diversi patogeni, cumprese SARS-CoV-2, leishmaniosi è malaria [47,48,49].L'HIV in u plasma isolatu hè lisatu direttamente, è l'acidu nucleicu virali hè arricchitu in a membrana di flussu FTA® integrata in u concentratore, chì permette a produzzione efficiente di l'acidu nucleicu [50] (Fig. 2c).U prublema principali cù a rilevazione di l'acidu nucleicu cù e carte FTA hè chì i sustanzi chimichi cum'è guanidine è isopropanol inibiscenu e reazzioni di amplificazione sussegwenti.Per risolve stu prublema, avemu sviluppatu a carta di filtru Fusion 5 modificata da chitosanu, chì combina i vantaghji di l'intrecciamentu fisicu di molécule di DNA è di carta di filtru fibru, è l'adsorzione elettrostatica di DNA nantu à composti modificati di chitosanu per ottene una estrazione di l'acidu nucleicu altamente efficiente. ..filtru fibre [51] (Fig. 2d).In listessu modu, Zhu et al.[52] hà dimustratu un metudu PCR modificatu di chitosanu basatu annantu à un sistema microfluidic capillare in situ per l'isolamentu rapidu è a rilevazione di l'RNA di virus Zika.L'acidi nucleici ponu esse adsorbiti / desorbiti in un mediu mistu lisatu / PCR, rispettivamente, basatu annantu à a pruprietà di l'interruttore on / off di chitosan.on and off", risponde à u pH.
Cumu l'esitatu sopra, queste strategie combina i vantaghji di diversi materiali in fase solida è aumentanu l'efficienza di l'estrazione di l'acidu nucleicu in a microfluidica.In l'applicazioni pratiche, l'usu di sti materiali in grande quantità ùn hè micca economicu, è u trattamentu propiu di a superficia o a mudificazione di a superficia di i materiali cumuni cù questi materiali pò ancu priservà a so funzione.Dunque, si crede chì l'implementazione di sti strategie dopu un studiu pilotu pò riduce i costi.
A prova di l'acidu nucleicu nantu à e piattaforme microfluidiche spessu usa picculi volumi di campioni (< 100 µl), dunque richiede l'amplificazione di l'acidi nucleici di destinazione cù sonde specifiche per a cunversione in un signalu chì hè cunvene per a rilevazione downstream (ottica, elettrica è magnetica) [53, 54]. A prova di l'acidu nucleicu nantu à e piattaforme microfluidiche spessu usa picculi volumi di campioni (< 100 µl), dunque richiede l'amplificazione di l'acidi nucleici di destinazione cù sonde specifiche per a cunversione in un signalu chì hè cunvene per a rilevazione downstream (ottica, elettrica è magnetica) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Quandu teste l'acidi nucleici nantu à e plataforme microfluidiche, sò spessu usati picculi volumi di mostra (<100 µL), cusì l'amplificazione di l'acidi nucleici di destinazione cù sonde speciali hè necessaria per cunvertisce in un signalu convenientu per a rilevazione successiva (ottica, elettrica è magnetica). [53, 54].微流控 台台 通常 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 (<100 μL), 因此因此 使用 特定, 以 转换 为 特定 检测 转换 为 检测 (光学, 学, 电 学 检测 磁学) 的 信号 [53, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. A rilevazione di l'acidi nucleici nantu à e piattaforme microfluidiche generalmente usa picculi volumi di mostra (<100 μl), chì richiede l'amplificazione di l'acidi nucleici di destinazione cù sonde speciale per cunvertisce in signali per a rilevazione successiva (ottica, elettrica è magnetica) [53, 54]] .L'amplificazione di l'acidu nucleicu in a microfluidica pò ancu accelerà e reazioni, ottimisà i limiti di rilevazione, riduce i requisiti di mostra è migliurà a precisione di rilevazione [55, 56].Nta l'ultimi anni, cù a realizazione di una deteczione rapida è precisa, diversi metudi di amplificazione di l'acidu nucleicu sò stati applicati in microfluidica, cumprese PCR è alcune reazzioni di amplificazione isotermale.Questa sezione riassumerà i metudi per a rilevazione di l'acidu nucleicu basatu nantu à i sistemi microfluidici.
A PCR hè una simulazione di u prucessu di replicazione di l'ADN di un urganismu, a teoria di quale hè descritta in dettagliu in altrò è ùn serà micca discututu quì.A PCR pò amplificà una quantità assai chjuca di DNA / RNA di destinazione à un ritmu esponenziale, facendu PCR un strumentu putente per a rilevazione rapida di l'acidi nucleici.Nta l'ultimi decennii, parechji dispositi microfluidici portatili equipati di sistemi di ciclichi termali PCR sò stati sviluppati per risponde à i bisogni di diagnostichi di u puntu di cura [57, 58].On-chip PCR pò esse divisu in quattru tippi (convenzionale, flussu cuntinuu, spazialmente cambiatu è PCR cunvective) secondu diversi metudi di cuntrollu di temperatura [59].Per esempiu, Gee et al.[60] hà sviluppatu un metudu di PCR quantitativa di trascrizzione inversa diretta (RT-qPCR) nantu à a so propria piattaforma microfluidica per a deteczione multiplex di SARS-CoV-2, virus influenza A è B in campioni di tamponi di gola (Fig. 3a).Park et al.[61] hà custruitu un chip di analisi di patogeni simplice integrendu PCR di film sottile, elettrodi è un modulu microfluidic basatu in polidimetilsiloxano operatu da dita.Tuttavia, e duie opere incarnanu i difetti cumuni di a PCR convenzionale.A PCR richiede un ciculu termale, chì limita a più miniaturizazione di u dispositivu è u tempu di prova ridutta.
U sviluppu di a PCR microfluidica è spaziale di u flussu continuu basatu hè criticu per affruntà stu prublema.Utilizendu un canale serpentina longu o un canale curtu drittu, a PCR di flussu cuntinuu pò furnisce una amplificazione rapida da reagenti circulanti attivamente in trè zoni di preriscaldamentu cù una pompa off-chip.Stu funziunamentu evita bè a fase di transizione trà e diverse temperature di reazzione è cusì riduce significativamente u tempu di prova [62] (Fig. 3b).In un altru studiu di Jung et al.[63] hà prupostu un novu analizatore geneticu rotativu di PCR chì combina e caratteristiche di PCR fissu è flussu per a PCR di trascrizzione inversa ultrafast è multiplex (Fig. 3c).Per l'amplificazione di l'acidu nucleicu, u microchip PCR serà rotatu attraversu trè blocchi di riscaldamentu à diverse temperature: 1. Bloccu di denaturazione 94 ° C, 2. Bloccu d'anneling à 58 ° C, 3. Blocu di espansione à 72 ° C.
Applicazione di a PCR in a microfluidica.Rappresentazione schematica di dirRT-qPCR nantu à una piattaforma microfluidica (adattata da [60]).b Rappresentazione schematica di un microarray PCR à flussu cuntinuu basatu annantu à un canale serpentina (adattatu da [62]).c Rappresentazione schematica di un analizzatore geneticu PCR rotativu, custituitu da un microchip, trè blocchi di riscaldamentu è un mutore stepper (adattatu da [63]).d Schema di PCR di termoconvezione cù centrifugazione è setup (adattatu da [64]).DirRT-qPCR, reazione a catena di polimerasi di trascrizione inversa quantitativa diretta
Utilizendu capillari è loops o ancu platti sottili, a PCR di cunvezione pò amplificà rapidamente l'acidi nucleici per cunvezione termale libera naturale senza a necessità di una pompa esterna.Per esempiu, una piattaforma microfluidica di polimeru di l'olefina ciclica hè stata sviluppata nantu à una tappa di calefazione rotativa fabbricata chì usa u ciculu termale cù centrifugazione in un microcanale di loop PCR [64] (Fig. 3d).A suluzione di reazzione hè guidata da a cunvezione termale, chì scambia continuamente a temperatura alta è bassa in un microcanale cù una struttura anulare.Tuttu u prucessu di amplificazione pò esse cumpletu in 10 minuti cù un limitu di deteczione di 70,5 pg / canale.
Cum'è previstu, a PCR rapida hè un strumentu putente per sistemi di diagnostica moleculare è di analisi multiplex cumpletamente integrati.A PCR rapida riduce significativamente u tempu necessariu per detectà SARS-CoV-2, chì cuntribuisce à u cuntrollu efficace di a pandemia di COVID-19.
A PCR richiede un termociclatore cumplessu chì ùn hè micca adattatu per POCT.Più recentemente, e tecniche di amplificazione isotermale sò state applicate à a microfluidica, cumprese, ma micca limitatu à LAMP, amplificazione di polimerasi recombinase (RPA), è amplificazione basata in sequenze d'acidu nucleicu [65,66,67,68].Cù sti tecnichi, l'acidi nucleici sò amplificati à una temperatura constante, facilitendu a creazione di apparecchi POCT portatili à pocu costu è assai sensibili per diagnostichi moleculari.
I saggi LAMP basati in microfluidica d'alta produzzione permettenu a rilevazione multipla di malatie infettive [42, 69, 70, 71].In cumbinazione cù un sistema microfluidic centrifugu, LAMP pò ancu facilità l'automatizazione di a rilevazione di l'acidu nucleicu [69, 72, 73, 74, 75].U SlipChip spin-and-react hè statu sviluppatu per a deteczione visuale di parechje battìri paralleli cù LAMP [76] (Fig. 4a).Quandu s'utilice LAMP ottimizatu in l'analisi, u rapportu signale-à-rumore di fluorescenza era di circa 5 volte, è u limitu di rilevazione hà righjuntu 7,2 copie / μl di DNA genomicu. Inoltre, l'esistenza di cinque patogeni bacteriali digestivi cumuni, cumpresi Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis è Vibrio parahaemolyticus, sò stati visualizzati in basa di u metudu in <60 min. Inoltre, l'esistenza di cinque patogeni bacteriali digestivi cumuni, cumpresi Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis è Vibrio parahaemolyticus, sò stati visualizzati in basa di u metudu in <60 min.Inoltre, a prisenza di cinque patogeni bacteriali cumuni di u trattu digestivu, cumprese Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis è Vibrio parahaemolyticus, hè stata visualizata cù stu metudu in menu di 60 minuti.此外, 基于 该 在 <60 分钟 内 可 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 原体 的 大存, 肠 沙门 氏 菌, 河流 弧菌 和和 副溶血性.此外, 基于 该 方法 在 五 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 大RIC 大, 弧菌弧菌 副溶血 性, 弧菌 和 弧菌 性, 弧菌弧菌 副溶血 性, 弧菌弧菌 副溶血 性, 弧菌弧菌 副溶血 性, 弧菌弧菌 副溶血 性. 弧菌 和 弧菌 性. 弧菌弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPInoltre, a prisenza di cinque patogeni gastrointestinali bacteriali cumuni, cumprese Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius è Vibrio parahaemolyticus, hè stata visualizata cù stu metudu in menu di 60 minuti.
I vantaghji di LAMP in a microfluidica includenu, frà altri, a risposta rapida è a rilevazione miniaturizzata.In ogni casu, per via di a temperatura di reazione (circa 70 ° C), l'aerosols sò inevitabbilmente generati durante LAMP, risultatu in un altu ritmu falsu pusitivu.A specificità di l'analisi, u disignu di l'amori è u cuntrollu di a temperatura anu ancu esse ottimizatu per LAMP.Inoltre, i disinni di chip chì implementanu a deteczione di target multipli in un unicu chip sò di grande valore è deve esse sviluppatu.Inoltre, LAMP hè adattatu per a deteczione multi-purpose integrata in un chip, chì hè di grande impurtanza, ma ci hè ancu assai spaziu per u sviluppu.
L'alta percentuale di falsi positivi di LAMP pò esse in parte ridutta cù RPA, postu chì a temperatura di reazione relativamente bassa (~ 37 ° C) risulta in relativamente pochi prublemi di evaporazione [77].In u sistema RPA, dui primers opposti inizianu a sintesi di l'ADN liendu à una recombinase è l'amplificazione pò esse cumpletata in 10 minuti [78,79,80,81].Dunque, tuttu u prucessu RPA hè assai più veloce di PCR o LAMP.Nta l'ultimi anni, a tecnulugia microfluidica hè stata dimustrata per migliurà ancu a velocità è a precisione di RPA [82,83,84].Per esempiu, Liu et al.[85] hà sviluppatu un test di amplificazione di recombinasi di polimerasi di flussu laterale integrata microfluidica per a rilevazione rapida è sensibile di SARS-CoV-2 integrendu a trascrizione inversa RPA (RT-RPA) è un sistema universale di rilevazione di strisce di prova di flussu laterale.in un unicu sistema microfluidic.Figura 4b).U limitu di rilevazione hè 1 copia / µl o 30 copie / campione, è a rilevazione pò esse cumpletata in circa 30 minuti.Kong et al.anu sviluppatu un dispositivu microfluidic wearable.[86] hà utilizatu a temperatura di u corpu è un sistema di rilevazione di fluorescenza basatu in telefuninu per detectà rapidamente è direttamente l'ADN di HIV-1 utilizendu RPA (Figura 4c).L'analisi RPA portabile rileva 100 copie/mL di a sequenza di destinazione in 24 minuti, dimustrendu un grande potenziale per a diagnosi rapida di i zitelli infettati da HIV-1 in paràmetri limitati di risorse.
Amplificazione isotermica in teste di puntu di cura (POCT).Sviluppu è pruduzzione di spin è reazione SlipChip.Dopu à a saldatura di plasma, i chips di cima è di fondu sò stati assemblati cù un set di noci per furmà u chip finali (adattatu da [76]).b Schema di u sistema MI-IF-RPA per a rilevazione di COVID-19 (adattatu da [85]).c Schema di un test RPA wearable per a rilevazione rapida di HIV-1 DNA (adattatu da [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, virus dell'immunodeficienza umana HIV, RPA recombinase polymerase amplification, LED light emitting diode, MI-IF-RPA Microfluiteraldic Polimerase integrata Amplificazione
L'RPA basatu in microfluidica si sviluppa rapidamente, però, u costu di a fabricazione di chip è u cunsumu di reazione hè troppu altu è deve esse ridutta per aumentà a dispunibilità di sta tecnulugia.Inoltre, l'alta sensibilità di RPA pò influenzà l'amplificazione di prudutti micca specifichi, in particulare in presenza di contaminazione.Queste limitazioni ponu influenzà l'applicazione di RPA in sistemi microfluidici è meritanu più ottimisazioni.Primi è sonde ben cuncepiti per diversi miri sò ancu necessarii per migliurà a fattibilità di strategie microfluidique basate in RPA in POCT.
Cas13 è Cas12a anu a capacità di scinderà l'acidi nucleici aleatoriu è cusì ponu esse sviluppati cum'è strumenti di rilevazione è diagnostichi.Cas13 è Cas12a sò attivati ​​annantu à u ligame à l'ADN di destinazione o RNA, rispettivamente.Una volta attivata, a proteina cumencia à scinderà l'altri acidi nucleici vicini, dopu chì i RNA guidati chì miranu à l'acidi nucleici specifichi di patogeni ponu scinderà sonde fluorescenti spente è liberanu fluorescenza.Basatu nantu à sta tiuria, Kellner et al.[87] hà sviluppatu un metudu basatu in Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], è Broughton et al.[88] hà sviluppatu un altru approcciu basatu annantu à Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)].
In l'ultimi anni, parechji metudi per a deteczione di l'acidi nucleici basati in CRISPR sò apparsu [89, 90].I metudi cunvinziunali basati in CRISPR sò spessu cunsumatori di tempu è travagliu intensivu per via di parechje prucedure cumprese l'estrazione di l'acidu nucleicu, l'amplificazione è a rilevazione CRISPR.L'esposizione di liquidi à l'aria pò aumentà a probabilità di risultati falsi pusitivi.In vista di ciò chì sopra, i sistemi basati in CRISPR anu un urgente bisognu di ottimisazione.
Una piattaforma microfluidica cuntrullata pneumaticamente chì pò fà 24 analisi in parallelu hè stata sviluppata per l'applicazioni di rilevazione CRISPR-Cas12a è CRISPR-Cas13a [91].U sistema hè dotatu di un dispositivu di rilevazione di fluorescenza chì bypassa l'amplificazione di l'acidu nucleicu è rileva automaticamente campioni di DNA è RNA femtomolar.Chen et al.[92] amplificazione di recombinase integrata cù u sistema CRISPR-Cas12a in microfluidica centrifuga (Fig. 5a).Stu travagliu supera a difficultà di integrà sti dui prucessi perchè Cas12a pò digerirà l'ADN di messageria è impedisce u prucessu di amplificazione.Inoltre, Chen et al.[92] hà ancu pre-almacenatu i reagenti di reazione in un cuntrollu microfluidic centrifugu per cumpletà automaticamente tuttu u prucessu.In un altru travagliu, Silva et al.[93] hà sviluppatu un metudu diagnosticu senza amplificazione CRISPR / Cas12a è un smartphone per detect SARS-CoV-2 (Fig. 5b).Stu test, cunnisciutu cum'è un sistema senza amplificazione basatu in telefuninu, include un enzima CRISPR / Cas-dipendente chì hè basatu annantu à a visualizazione di smartphone di i segnali di bolle generati da catalasi in canali microfluidici.Rilevazione sensibile di menu di 50 copie / µl di l'acidu nucleicu senza pre-amplificazione, tuttu u prucessu da l'iniezione di campionu à a lettura di u signale dura solu 71 minuti.
Metodi di rilevazione di l'acidu nucleicu basatu nantu à CRISPR.POCT centrifuga per u diagnosticu moleculare integratu basatu annantu à CRISPR (adattatu da [92]).b Sviluppu di a prova CASCADE per l'analisi basata in smartphone di SARS-CoV-2 (adattata da [93]).Amplificazione di RAA recombinase, motivo di protospacer adiacente PAM, ripetizioni palindromiche brevi cluster CRISPR a intervalli regolari, sistema CASCADE senza amplificazione di telefoni cellulari con enzimi dipendenti da CRISPR/CAS, 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimide cloridrato EDC
Cum'è l'ultimu passu in a rilevazione di l'acidu nucleicu, a rilevazione di signali riflette direttamente i risultati di diagnostichi è hè un fattore criticu in u sviluppu di un POCT efficiente, sensitivu è precisu.I signali ponu esse letti cù diversi metudi cum'è strategie fluorescenti, elettrochimiche, colorimetriche è magnetiche.In questa sezione, descrivimu a logica per ogni approcciu è paragunate i diagnostichi moleculari di e malatie infizziose in microfluidica.
E strategie basate in fluorescenza sò largamente usate per u diagnosticu POCT di e malatie infettive per via di i so vantaghji notevuli di una sensibilità eccellente, u costu bassu, a facilità di operazione è l'analisi di u puntu di cura [94, 95].Queste strategie utilizanu fluorofori marcati cum'è tinture fluorescenti è nanomateriali per creà un signalu detectable (migliu di fluorescenza o quenching).Questa scuperta suggerisce chì e strategie basate in fluorescenza ponu esse divise in etichettatura fluorescente diretta, rilevazione fluorescente di signal-on è signal-off [96].A rilevazione diretta di etichette fluorescenti utilizza etichette fluorescenti speciali per etichettare ligandi specifichi chì generanu una quantità specifica di fluorescenza quandu si ligate selettivamente à un mira.Per a rilevazione di fluorescenza basata in u signale, a qualità di u signale fluorescente hè positivamente ligata à a magnitudine di interessu.L'intensità di fluorescenza hè insignificante in l'assenza di un mira è hè detectable quandu una quantità sufficiente di mira hè presente.À u cuntrariu, l'intensità di fluorescenza rilevata da a fluorescenza "signal-off" hè inversamente proporzionale à a quantità di u target, inizialmente righjunghjendu un valore massimu è diminuisce gradualmente cum'è u target hè allargatu.Per esempiu, utilizendu u CRISPR-Cas13a u meccanismo di trans-clivage dipendente da u target, Tian et al.[97] hà sviluppatu una nova strategia di ricunniscenza per detectà RNAs chì bypassa a trascrizione inversa direttamente (Fig. 6a).Dopu à u ligame à l'ARN di destinazione cumplementarii, u cumplessu CRISPR-Cas13-RNA pò esse attivatu, inducendu a clivatura transcollaterale da RNA reporter non specifichi.U reporter marcatu fluorescente [fluorophore (F)] hè spentu da u quencher (Q) intactu è fluoresce quandu scinde da u cumplessu attivatu.
U vantaghju di a rilevazione elettrochimica hè una alta velocità di rilevazione, una produzzione faciule, un costu bassu, un cuntrollu faciule è un cuntrollu automaticu.Hè un metudu analiticu putente per l'applicazioni POCT.Basatu nantu à i transistori à effettu di campu di grafene Gao et al.[98] hà sviluppatu un nanobiosensor per a deteczione multiplex di l'antigens di a malatia di Lyme da a bacteria Borrelia burgdorferi cun un limitu di deteczione di 2 pg / mL (Fig. 6b).
L'assai colorimetrici sò stati utilizati in l'applicazioni POCT, chì benefiziu di i vantaghji di portabilità, low cost, facilità di preparazione è lettura visuale.A rilevazione colorimetrica pò utilizà l'ossidazione di perossidasi o nanomateriali simili à perossidasi, l'agregazione di nanomateriali, è l'aghjunzione di tinture indicatori per cunvertisce l'infurmazioni nantu à a presenza di l'acidi nucleici di destinazione in cambiamenti di culore visibili [99, 100, 101].In particulare, i nanoparticuli d'oru sò largamente usati in u sviluppu di strategie colorimetriche, è per via di a so capacità di induce cambiamenti rapidi è significativi di u culore, ci hè un interessu crescente in u sviluppu di e plataforme colorimetriche POCT per a diagnosi in situ di malatie infettive [102].Cù un dispositivu microfluidic centrifugal integratu [103], i patogeni di l'alimentu in i campioni di latti contaminati ponu esse rilevati automaticamente à u livellu di 10 cells bacterial, è i risultati ponu esse leghjite visualmente in 65 minuti (Fig. 6c).
I tecnichi di sensazione magnetica ponu detectà accuratamente l'analiti cù materiali magnetichi, è ci hè statu un interessu significativu in l'applicazioni POCT in l'ultimi decennii.I tecnichi di sensazione magnetica anu alcuni vantaghji unichi, cum'è materiali magnetichi à pocu costu piuttostu cà cumpunenti ottichi caru.Tuttavia, l'usu di un campu magneticu migliurà l'efficienza di rilevazione è riduce u tempu di preparazione di mostra [104].Inoltre, i risultati di a sonda magnetica dimustranu una alta specificità, sensibilità è un altu rapportu signal-à-rumore per via di u signale di fondo magneticu insignificante di campioni biologichi [105].Sharma et al.hà integratu un biosensore basatu in un tunnel magneticu in una piattaforma di microchip portable.[106] per a deteczione multiplex di i patogeni (Fig. 6d).I biosensori rilevanu sensibilmente l'acidi nucleici subnanomolari isolati da i patogeni.
Metudu tipicu di rilevazione di signali.U cuncettu di deteczione iperlocalizzata di Cas13a (adattata da [97]).b Nanobiosensor FET di grafene in combinazione cù Lyme GroES scFv (adattatu da [98]).c Indicazioni colorimetriche per a deteczione multiplex di patogeni di l'alimentu in un chip microfluidic centrifugal: campioni n ° 1 è n ° 3 cù patogeni di destinazione, è campioni n ° 2, n ° 4 è n ° 5 senza patogeni di destinazione (adattatu da [103]) .d Biosensore basatu annantu à una junzione di tunnel magneticu, cumprese una piattaforma, un amplificatore di bloccu integratu, una unità di cuntrollu è una fonte d'energia per a generazione / acquisizione di signali (adattatu da [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polimetilmetacrilato
Malgradu e caratteristiche eccellenti di i metudi di deteczione sopra, anu sempre svantaghji.Questi metudi sò paragunati (tavula 1), cumprese alcune applicazioni cù dettagli (pros è cuns).
Cù u sviluppu di a microfluidica, i sistemi microelettromeccanici, a nanotecnologia è a scienza di i materiali, l'usu di chips microfluidichi per a rilevazione di malatie infettive hè in constantemente avanzata [55,96,107,108].A manipulazione precisa di l'equipaggiu è di i fluidi in miniatura cuntribuisce à a precisione di diagnostica è à u costu.Dunque, per u sviluppu ulteriore, i sforzi sò stati fatti per ottimisà è aghjurnà i chips, risultatu in vari chips microfluidichi cù strutture è funzioni differenti.Quì intruducemu brevemente parechji tippi cumuni di piattaforme microfluidiche è paragunate e so caratteristiche (pros è cuns).Inoltre, a maiò parte di l'esempii elencati quì sottu si concentranu principalmente in a lotta à u SARS-CoV-2.
I LOCC sò i sistemi analitici cumplessi miniaturizzati più cumuni è e so operazioni sò assai miniaturizzati, integrati, automatizati è parallelizzati da l'iniezione è a preparazione di mostra, u cuntrollu di flussu è a rilevazione di liquidi [109, 110].I liquidi sò manipulati per mezu di una geometria cuncepita cù cura è l'interazzione di parechji effetti fisichi cum'è gradienti di pressione, azione capillare, elettrodinamica, campi magnetichi è onde acustiche [111].LOCC mostra vantaghji eccellenti in u screening high-throughput è a rilevazione multipla, cù una velocità di analisi rapida, una piccula dimensione di mostra, un bassu cunsumu d'energia, è una alta efficienza di gestione è operazione;però, i dispusitivi LOCC sò assai dilicati, è fabricazione, imballaggio, è interfaccia.Tuttavia, u multiplexing è a riutilizazione facenu enormi difficultà [96].Comparatu à l'altri piattaforme, LOCC hà vantaghji unichi in quantu à a diversità massima di l'applicazioni è a megliu cumpatibilità di a tecnulugia, ma i so svantaghji sò ancu evidenti, vale à dì alta cumplessità è poca ripetibilità.A dependenza di i pompi esterni, chì sò spessu voluminosi è caru, limita ancu u so usu in POCT.
Durante u focu COVID-19, LOCC hà ricevutu assai attenzione.À u listessu tempu, ci sò parechji novi chips chì combina parechje tecnulugia.Per esempiu, i telefoni smartphones sò oghji largamente usati cum'è dispositi analitici portatili è anu un grande potenziale per l'integrazione LOCC.Sun et al.[21] hà fabbricatu un chip microfluidic chì permette di multiplexing sequenze d'acidu nucleicu specificu di cinque patogeni, cumpresu SARS-CoV-2, utilizendu LAMP è analizatu cù un smartphone in 1 ora dopu a fine di a reazione.Comu un altru esempiu, Sundah et al.[112] hà creatu un interruttore moleculare [amplificazione catalitica da u cambiamentu di u statu di transizione moleculare (CATCH)] per a rilevazione diretta è sensitiva di obiettivi di RNA SARS-CoV-2 utilizendu smartphones. CATCH hè cumpatibile cù LOCC portable è ottene prestazioni superiori (circa 8 copie RNA / μl; < 1 h à a temperatura di l'ambienti) [112]. CATCH hè cumpatibile cù LOCC portable è ottene prestazioni superiori (circa 8 copie RNA / μl; < 1 h à a temperatura di l'ambienti) [112]. Catch ToTовместим Пнымативным LOC Ооет восевосевосевосеводирно 8 копий <1 ч Перерат) [112]. CATCH hè cumpatibile cù LOCC portatile è furnisce un rendimentu eccellente (circa 8 copie RNA/µl; < 1 h à a temperatura di l'ambienti) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH совместим с портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/мкл; < 1 часа при комнатной температуре) [112]. CATCH hè cumpatibile cù i LOCC portatili è hà prestazioni eccellenti (circa 8 copie RNA / µl; < 1 ora à a temperatura di l'ambienti) [112].Inoltre, i dispositi LOCC per a diagnostica moleculare utilizanu ancu alcune forze motrici cum'è vacuum, stretch, è campi elettrici.Kang et al.[113] hà dimustratu una PCR nanoplasma-on-a-chip ultra-veloce in tempu reale per un diagnosticu rapidu è quantitatu di COVID-19 in u campu utilizendu un chip PCR di liquidu plasmonicu in vacuum.Li et al.[114] hà sviluppatu in seguitu un chip microfluidic stretch-driven chì hà permessu a diagnosi di COVID-19.A piattaforma usa u sistema di amplificazione RT-LAMP per determinà se una mostra hè qualitativamente positiva o negativa.In seguitu, Ramachandran et al.[115] hà ottenutu gradienti di campu elettricu adattatu utilizendu isotachophoresis (ITP), una tecnica di focalizazione selettiva di ioni implementata in microfluidica.Cù ITP, l'RNA di destinazione da campioni di tamponi nasofaringeali crudi ponu esse purificati automaticamente.Allora Ramachandran et al.[115] Cumminendu sta purificazione ITP cù l'analisi LAMP è CRISPR potenziate da ITP, hà rilevatu SARS-CoV-2 in tamponi nasofaringei umani è campioni clinichi in circa 35 minuti.Inoltre, idee novi sò sempre emergenti.Jadhav et al.[116] hà prupostu un schema di diagnosticu basatu annantu à a spettroscopia Raman di a superficia in cumbinazione cù un dispositivu microfluidic chì cuntene sia nanotubi di carbone rivestiti d'oru / argentu orientati verticalmente o micro / nanotubi elettrofilati dispunibuli.I microcanali di filtru integrati funziunati da a membrana sò dispunibuli.U dispusitivu adsorbe virus da diversi fluidi / essudazioni di u corpu cum'è saliva, nasofaringe è lacrime.Cusì, u titulu di virus hè abbundante è u virus pò esse identificatu accuratamente da a firma Raman.
LOAD hè una piattaforma microfluidica centrifuga in quale tutti i prucessi sò cuntrullati da un protocolu di frequenza chì rota un sustrato microstrutturatu [110].U dispusitivu LOAD hè carattarizatu da aduprà a forza centrifuga cum'è una forza motrice impurtante.I liquidi sò ancu sottumessi à e forze capillari, di Euler è di Coriolis.Utilizendu un dispositivu di centrifuga, l'analisi sò eseguite in un funziunamentu di liquidu cuntinuu da una pusizione radiale interna à esterna, eliminendu a necessità di tubi esterni supplementari, pompe, attuatori è valvole attive.In cortu, un metudu di cuntrollu unicu simplifica l'operazione.E forze chì agiscenu nantu à u liquidu in u stessu canali microfluidic à a listessa distanza da u centru di carica sò uguali, chì permette di ripetiri a struttura di u canali.Cusì, l'equipaggiu LOAD hè più simplice è più economicu per cuncepimentu è fabricazione di l'equipaggiu LOCC convenzionale, mentre chì e reazzione sò largamente indipendenti è parallelizate;in ogni modu, per via di l'alta forza meccanica di l'equipaggiu centrifuga, u materiale di chip dispunibule hè limitatu è i picculi volumi sò difficiuli.à a vittura.À u listessu tempu, a maiò parte di i dispositi LOAD sò pensati per un usu unicu, chì hè caru per a rilevazione à grande scala [96, 117, 118, 119].
In l'ultimi decennii, LOAD, cunsideratu unu di i dispositi microfluidici più promettenti, hà ricevutu assai attenzione da i circadori è i pruduttori.Cusì, LOAD hà guadagnatu una larga accettazione è hè stata aduprata per diagnostichi moleculari di patogeni infettivi [120, 121, 122, 123, 124], in particulare durante u focu COVID-19.Per esempiu, à a fine di u 2020, Ji et al.[60] hà dimustratu un test RT-qPCR direttu per a rilevazione parallela rapida è automatizata di infezioni SARS-CoV-2 è influenza A è B in campioni di tamponi di gola.Allora Xiong et al.[74] hà prisentatu una piattaforma microfluidica discoide integrata in LAMP per a rilevazione rapida, precisa è simultanea di sette coronavirus respiratorii umani, cumprese SARS-CoV-2, in 40 minuti.In principiu di 2021, de Oliveira et al.[73] hà dimustratu un chip microfluidico centrifugu di toner di polistirene, operatu manualmente cù un rotatore di punta di dita, per a diagnosi moleculare RT-LAMP di COVID-19.In seguitu, Dignan et al.[39] hà prisentatu un microdispositivu di centrifuga portatile automatizatu per a purificazione di l'RNA SARS-CoV-2 direttamente da sezioni di tampone buccale.Medved et al.[53] hà prupostu un sistema di campionamentu d'aerosol SARS-CoV-2 in linea cù un chip fluorescente microfluidic rotante di pocu volume cun un limitu di rilevazione di 10 copie / μL è un sogliu minimu di ciclu di 15 minuti.Suarez et al.[75] hà riportatu recentemente u sviluppu di una piattaforma microfluidica centrifuga modulare integrata per a rilevazione diretta di SARS-CoV-2 RNA in campioni di tamponi nasofaringeali inattivati ​​da u calore cù LAMP.Questi esempi dimostranu i grandi benefici è a prumessa di LOAD in a diagnostica moleculare di COVID-19.
In u 1945 Muller è Clegg [125] prisintò per a prima volta i canali microfluidichi nantu à carta cù carta di filtru è paraffina.In u 2007, u gruppu Whitesides [126] hà creatu a prima piattaforma di carta funzionale per a prova di prutezione è di glucose.A carta hè diventata un sustrato ideale per a microfluidica.A carta hà proprietà intrinseche cum'è l'idrofilia è a struttura porosa, eccellente biocompatibilità, pesu ligeru, flessibilità, piegabilità, low cost, facilità d'usu è comodità.I µPAD classici sono costituiti da strutture idrofile/idrofobiche costruite su substrati di carta.Sicondu a struttura tridimensionale, i μPAD ponu esse divisi in μPAD bidimensionali (2D) è tridimensionali (3D).I µPAD 2D sono prodotti formando confini idrofobici per formare canali microfluidici, mentre i µPAD 3D sono generalmente realizzati da pile di strati di carta microfluidica 2D, a volte mediante piegatura della carta, tecniche di slittamento, canali aperti e stampa 3D [96].I fluidi aquosos o biologichi nantu à u μPAD sò principarmenti cuntrullati da a forza capillare senza una fonte di energia esterna, facilitendu u pre-magazzinu di reagenti, a manipulazione di campioni è a rilevazione multiplex.Tuttavia, u cuntrollu precisu di u flussu è a rilevazione multiplex sò ostaculati da una velocità di rilevazione insufficiente, sensibilità è reutilizazione [96, 127, 128, 129, 130].
Cum'è una piattaforma microfluidica inusual, μPAD hè statu largamente prumuvutu è sviluppatu per u diagnosticu moleculare di e malatie infettive cum'è HCV, HIV è SARS-CoV-2 [131, 132].Per a rilevazione selettiva è sensitiva di HCV, Tengam et al.[133] hà sviluppatu un novu biosensore basatu in carta fluorescente utilizendu una sonda di l'acidu nucleicu altamente specificu basata in peptide pirrolidinil.L'acidi nucleici sò immobilizzati in modu covalente nantu à carta di cellulosa parzialmente ossidata per alchilazione riduttiva trà gruppi amminichi è gruppi aldeide, è a rilevazione si basa in fluorescenza.Questi signali ponu esse leghjiti da un gadget apposta cù una camera fluorescente portatile in combinazione cù una camera di telefuninu.In seguitu, Lu et al.[134] hà cuncepitu un elettrodu flessibile basatu in carta basatu in nanoparticelle di nichel / d'oru / nanotubi di carbone / composti di struttura organometallica d'alcool polivinilico per a rilevazione di mira di HIV per l'ibridazione di DNA utilizendu blu di metilene cum'è indicatore redox di DNA.Più recentemente, Chowdury et al.[135] hà prisentatu un disignu di piattaforma ipotetica per a prova µPAD di u puntu di cura utilizendu saliva cruda di u paziente in combinazione cù LAMP è tecnulugia di imaging portable per a rilevazione di l'analita COVID-19.
I testi di flussu laterale guidanu i fluidi per forze capillari è cuntrolanu u muvimentu di u fluidu da a bagnabilità è e caratteristiche di sustrati porosi o microstrutturati.I dispositi di flussu laterale sò custituiti da campioni, cunjugati, incubatori è rilevazione, è pads assorbenti.E molécule di l'acidu nucleicu in l'LFA ricunnoscenu ligaturi specifichi chì sò pre-magazzini in u situ di ubligatoriu è si liganu cum'è cumplessi.Quandu u liquidu passa per i platti d'incubazione è di deteczione, i cumplessi sò catturati da e molécule di cattura situate nantu à e linee di teste è di cuntrollu, chì mostranu risultati chì ponu esse leghje direttamente à l'occhiu nudu.Di genere, LFA pò esse cumpletu in 2-15 minuti, chì hè più veloce di a scuperta tradiziunale.A causa di u mekanismu spiciale, LFA richiede pochi operazioni è ùn hè micca bisognu di equipaggiu supplementu, chì a rende assai amichevule.Hè faciule fà fà è miniaturizà, è u costu di sustrati basati in carta hè più bassu.In ogni casu, hè solu utilizatu per l'analisi qualitativa, è a deteczione quantitativa hè assai difficiuli, è a capacità di multiplexing è u throughput sò assai limitati, è solu un solu àcitu nucleicu pò esse rilevatu à tempu [96,110,127].
Ancu se a maiò parte di l'applicazioni di LFA sò focalizati in immunoassay, l'usu di LFA per diagnostichi moleculari in chips microfluidichi hè ancu efficace è populari [136].In u casu di l'hepatitis B virus, HIV è SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] hà prupostu una piattaforma LFA di nanoparticule up-conversione è hà dimustratu a versatilità di sta piattaforma miniaturizzata è portatile per mezu di a rilevazione sensitiva è quantitativa di parechji miri cum'è l'acidu nucleicu HBV.Inoltre, Fu et al.[138] hà dimustratu un novu LFA basatu nantu à spettroscopia Raman superficia per l'analisi quantitativa di HIV-1 DNA à bassu cuncentrazione.Per a rilevazione rapida è sensibile di SARS-CoV-2, Liu et al.[85] hà sviluppatu un'analisi di flussu laterale RPA integrata microfluidica cumminendu RT-RPA è un sistema universale di rilevazione di flussu laterale in un unicu sistema microfluidic.
L'applicazione di diverse piattaforme microfluidiche varieghja secondu studii specifichi, apprufittendu pienamente e capacità è i vantaghji di e piattaforme.Cù valvole, pompe è canali à prezzi accessibili, LOCC hè a piattaforma più cumpleta per a diversità di l'applicazioni è l'interoperabilità cù u più grande spaziu per u sviluppu.Dunque, speramu è ricumandemu chì i studii più recenti sò realizati à LOCC cum'è un primu tentativu è chì e cundizioni sò ottimisate.Inoltre, i metudi più efficaci è precisi sò previsti per esse scuperti è usati in u sistema.LOAD eccelle in u cuntrollu precisu di i fluidi da i dispositi LOCC esistenti è dimostra vantaghji unichi in unità singole per forza centrifuga senza a necessità di unità esterne, mentre chì e risposte parallele ponu esse separate è sincronizate.Cusì, in u futuru, LOAD diventerà a piattaforma microfluidica principale cù menu operazioni manuali è tecnulugia più mature è automatizate.A piattaforma µPAD combina i vantaghji di LOCC è di materiali basati in carta per un diagnosticu unicu à pocu costu.Dunque, u sviluppu futuru deve fucalizza nantu à tecnulugii convenienti è ben stabiliti.Inoltre, l'LFA hè bè adattatu per a rilevazione di l'occhiu nudu, prumettendu di riduce u cunsumu di mostra è di accelerà a rilevazione.Un paragone detallatu di a piattaforma hè mostratu in a Tabella 2.
L'analisi digitale dividenu a mostra in parechji microreattori, ognunu di i quali cuntene un numeru discretu di molécule di destinazione [139, 140].I saggi digitali offrenu vantaghji significativi per a realizazione di quantificazione assoluta eseguendu migliaia di esperimenti biochimici paralleli simultaneamente è individualmente in compartimenti di scala micron piuttostu cà in una fase continua.In cunfrontu à a microfluidica tradiziunale, e reazioni di i compartimenti ponu riduce u voluminu di mostra, aumentanu l'efficienza di reazione, è esse facilmente integrate cù altri metudi analitici senza bisognu di canali, pompe, valvole è disinni compacti [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].I seguenti dui metudi sò usati in l'assai digitale per ottene una separazione uniforme è precisa di suluzione, cumpresi reagenti è campioni, cum'è cellule, acidi nucleici è altre particelle o molécule: (1) emulsioni di goccia sfruttendu inestabilità di l'interfaccia di liquidu;(2) a divisione di l'array hè realizata da e restrizioni geometriche di u dispusitivu.In u primu metudu, gocce chì cuntenenu reagenti è campioni in microchannels ponu esse creati da metudi passivi cum'è co-current, crossflow, flow focusing, staged emulsification, microchannel emulsification, and membranes through viscose shear forces and emulsification with channel change.localizazione [143, 145, 146, 148, 149] o utilizendu metudi attivi [150, 151], chì introducenu energia addiziale per u cuntrollu elettricu, magneticu, termicu è meccanicu.In l'ultimu approcciu, a megliu uniformità di u voluminu fluidu in e camere microfluidiche hè spartuta da mantenendu strutture spaziali di a stessa dimensione, cum'è micropits è arrays di superficia [152,153,154].In particulare, e gocce sò sezioni di flussu maiò chì ponu ancu esse generate è manipulate nantu à arrays d'elettrodi basati nantu à a microfluidica digitale (DMF).Electrowetting di dielectrics hè una di e teorie DMF megliu studiatu, postu chì l'elettrowetting di dielectrics permette una manipulazione precisa di gocce individuali, cuntrullendu a forma di u liquidu è i segnali elettrici asimmetrici chì passanu per diversi lati [141, 144].L'operazioni principali cù gocce in DMF includenu a classificazione, a splitting, è a fusione [151, 155, 156], chì ponu esse appiicati in diversi campi di analisi, in particulare in a rilevazione moleculare [157, 158, 159].
A rilevazione di l'acidu nucleicu digitale hè una tecnulugia di diagnostica moleculare di terza generazione chì seguita a PCR convenzionale è a PCR quantitativa in tempu reale (qPCR), in parallelu cù sequencing high-throughput è biopsia liquida.In l'ultimi dui decennii, l'acidi nucleici digitali si sò sviluppati rapidamente in u campu di diagnostichi moleculari di i patogeni infettivi [160, 161, 162].A quantificazione assoluta di a rilevazione di l'acidu nucleicu digitale principia cù l'imballaggio di campioni è reagenti in compartimenti individuali per assicurà chì ogni sequenza di destinazione hà a stessa probabilità di entre in ogni compartimentu individuale.In teoria, ogni sezione pò esse attribuita à parechje sequenze di destinazione, o ùn pò esse micca un sistema di microreazione indipendente.Attraversu i varii meccanismi di sensazione descritti sopra, i compartimenti cù sequenze di mira microbiche chì generanu segnali sopra à un certu sogliu pò esse visualizati à l'occhiu nudu o da una macchina è sò etichettati cum'è pusitivi, mentre chì altri compartimenti chì generanu segnali sottu à u limitu sò etichettati cum'è pusitivi. .negativi, chì facenu u signale per ogni rùbbrica un boolean.Cusì, calculendu u nùmeru di compartimenti creati è a rata di risultati pusitivi dopu a reazione, e copie originali di i campioni di teste ponu esse cumminate cù a formula di distribuzione di Poisson senza a necessità di una curva standard, chì hè necessaria per l'analisi quantitative di rutina cum'è qPCR.[163] In cunfrontu cù i metudi di diagnostichi moleculari tradiziunali, a rilevazione di l'acidu nucleicu digitale hà un gradu più altu di automatizazione, una velocità d'analisi più alta è sensibilità, menu reagenti, menu contaminazione, è cuncepimentu è fabricazione più simplici.Per questi motivi, l'usu di saggi digitali, in particulare i metudi basati in gocce, per diagnostichi molecolari, cumminendu tecniche di amplificazione è di lettura di segnali, hè statu ben studiatu durante u focu criticu di SARS-CoV-2.Per esempiu, Yin et al.[164] combinate i metudi di PCR digitale di gocce è veloci per detectà i geni ORF1ab, N, è RNase P in SARS-CoV-2 in un chip microfluidic.In particulare, u sistema hà sappiutu identificà un signalu pusitivu in 115 seconde, chì hè più veloce di a PCR convenzionale, chì indica a so efficacità in a rilevazione di u puntu di cura (Figura 7a).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] è Alteri et al.[167] hà ancu applicatu a PCR digitale a goccia (ddPCR) per detectà SARS-CoV-2 in un sistema microfluidic cun risultati impressiunanti.Per migliurà ulteriormente a rata di rilevazione, Shen et al.[168] hà ottinutu l'imaghjini di chip basati in ddPCR in appena 15 s senza l'usu di tecniche di stitching d'imaghjini, accelendu u prucessu di tecnulugia ddPCR da u laboratoriu à l'applicazione.Micca solu i metudi di amplificazione termale cum'è a PCR sò applicati, ma ancu i metudi di amplificazione isotermale sò usati per simplificà e cundizioni di reazione è a risposta rapida.Lu et al.[71] hà sviluppatu SlipChip per l'analisi di gocce, capace di generà gocce di diverse dimensioni à alta densità in un passu è quantificà l'acidi nucleici SARS-CoV-2 utilizendu LAMP digitale (Figura 7b).Cum'è una tecnulugia in rapida evoluzione, CRISPR pò ancu ghjucà un rolu impurtante in a rilevazione di l'acidu nucleicu digitale attraversu l'imaghjini colorimetrici convenienti senza a necessità di macchie d'acidu nucleicu supplementari.Ackerman et al.hà sviluppatu una reazione matrice combinatoria per a valutazione multiplex di l'acidi nucleici.[158] hà rilevatu 169 virus assuciati à l'omu, cumpresu SARS-CoV-2, in gocce chì cuntenenu reagenti di rilevazione di l'acidu nucleicu basatu in CRISPR-Cas13 in un test di microwell (Figura 7c).Inoltre, l'amplificazione isotermica è a tecnulugia CRISPR ponu esse aduprate in u stessu sistema per cumminà i benefici di i dui.Park et al.[169] Un test digitale CRISPR/Cas12a hè statu sviluppatu in un chip microfluidic cummerciale per a rilevazione di SARS-CoV-2 estratti è uccisi da u calore basatu annantu à un RT-RPA in una sola fase cù una rilevazione di signale à fondo più corta è più alta. rapportu di tempu., una gamma dinamica più larga è una sensibilità megliu (Fig. 7d).Alcune descrizzioni di questi esempi sò datu in a Tabella 3.
Piattaforma digitale tipica per a rilevazione di l'acidu nucleicu.a U flussu di travagliu PCR digitale rapidu hè custituitu da quattru tappe chjave: preparazione di campioni, distribuzione di a mistura di reazione, prucessu di amplificazione è quantificazione di destinazione (adattata da [164]).b Schematicu chì mostra l'analisi di gocce SlipChip per a furmazione di gocce à alta densità (adattatu da [71]).c Diagramma di workflow CARMEN-Cas13 (adattatu da [158]).d Panoramica di a rilevazione avanzata di virus digitale cù CRISPR/Cas in una sola pot (adattata da [169]).W / O acqua in oliu, polidimetilsilossano PDMS, reazione a catena di polimerasi PCR, raccolta di dati DAQ, derivata integrale proporzionale PID, reazione di matrice combinatoria CARMEN per a valutazione di l'acidu nucleicu multiplex, SARS-CoV-2, sindromu respiratoriu acutu severu, coronavirus 2 , RT Amplificazione di reverse transcriptase recombinase polymerase-RPA, signal S/B in background